166840. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikumok előállítására

166840 15 50 ml, a következő összetételű steril táptalajt oltunk: Glükóz 15,0 g Szójadara 15,0 g Kukoricalekvár 10,0 g NaCl 5,0 g CaCOg 2,0 g Csapvíz 1,1 liter A táptalaj pH-ját nátriumhidroxid oldattal 6,5-re állítjuk be, ezután 7,5—10 atmoszféra nyomáson, 30 percen át autoklávban sterilezzük. A táptalaj pH-ja sterilezés után változatlanul 6,5. A beoltott táptalajt 250 percenkénti fordulatszámú rázóasztalon 30 °C hőmérsékleten 72 órán át tenyésztjük. Ezután 10 ml tenyészettel 1 literes lombikokban sterilezett, 200 ml fenti összetételű táptalajt oltunk. A beoltott táptalajt percenként 250-et forduló rázóasztalon, 30 °C hőmérsékleten 30 percen át rázatjuk. 200 ml tenyészettel 40 liter hasznos térfogatú fermentorban 25 liter táptalajt oltunk. A táptalaj a következő összetételű: 16 Glükóz 25 g Szójadara 15 g Savval hidrolizált kazein 1 g Melasz 3 g CaCOs 2,5 g Csapvíz 1 liter A táptalajt 7,5—10 atmoszféra nyomáson 30 percen át autoklávban sterilezzük, amiután pH-ja 7,2. A beoltott táptalajon percenként 6,5 liter levegőt buborékoltatunk át és a szokásosan használt keverővel (350 fordulat/perc) keverjük. A fermentációt 30 °C hőmérsékleten 5 napon át folytatjuk. 3. példa Az antibiotikum-keverék elkülönítése 92 liter Streptomyces albus NRRL 3883 tenyészetet a szokásosan használt szűrési segédanyag adagolása után szűrünk. A micéliumot 25 liter metanolban szuszpendáljuk és 30—60 percen át erőteljesen keverjük. Ezután szűrjük a szuszpenziót, a szűrletet bepároljuk. A desztillációs maradékként kapott vizes fázist a tenyészlé szűrése után kapott szűrlettel egyesítjük. Az extrahált micéliumot 25 liter etilacetátban szuszpendáljuk, a szuszpenziót 30—60 percen át keverjük, majd szűrjük, a micéliumot kidobjuk. A szűrt tenyészlevet kétszer fél térfogat etilacetáttal extraháljuk, a vizes fázist kidobjuk. Az etilacetátos fázist a micélium extrakciójára használt etilacetáttal egyesítjük. Űgy is eljárhatunk, hogy az A 28695 antibiotikumokat a tenyészléből annak szűrése nélkül különítjük el. A következő eljárást használjuk: 92 liter tenyészléhez annak térfogatával egyenlő térfogatú etilacetátot adunk és keverjük 10 15 20 25 30 35 40 45 50 60 65 az elegyet. Szűrés után etilacetátos és vizes fázisra különítjük el a szűrletet. A vizes fázist kidobjuk, a szerves oldószeres extraktumot eltesz-szük. Az extrahált micéliumot ezután etilacetáttal még egyszer extraháljuk. A micéliumot kidobjuk, a szerves oldószert az első extraktummal egyesítjük. Az egyesített extraktumot desztillálva olajos desztillációs maradékot kapunk, ezt 1 liter kloroformban oldjuk. Az oldatot 5,5x100 cm-es, Pittsburgh aktív szénnel (12x40 mesh) töltött kromatografáló oszlopon engedjük át. Az eluálást 20 liter kloroformmal végezzük. A kloroformos eluátumokat és mosófolyadékot egyesítjük, és desztillációval eltávolítjuk az oldószert. Száraz desztillációs maradékként 70,4 g A 28695-öt kapunk. 4. példa Az A 28695A és az A 28695B antibiotikumok elválasztása A 3. példa szerinti eljárással előállított A 28695 antibiotikum-keverék 30 grammját benzol és etilacetát 9:1 arányú elegyében oldjuk. Az oldatot 5,5x115 cm méretű szilikagél (N° 62, Davison Chemical, Baltimore, Maryland 21226) oszlopon kromatografáljuk. A hatóanyag felvitele előtt benzol és etilacetát 9:1 arányú elegyével mossuk az adszorbenst. A kromatografáló oszlopot 6 liter hasonló összetételű oldószereleggyel mossuk, az eluátumot és a mosófolyadékot kidobjuk. Ezután benzol és etilacetát 4:1 arányú elegyével eluáljuk a hatóanyagot. Az oszlopról a korai frakciókban oldódik le az A 28695A, míg az A 28695B később jelenik meg az eluátumban. Az antibiotikumok azonosítását papír- vagy vékonyréteg-kromatográfiával végezzük. A hasonló antibiotikumokat tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. Desztillációs maradékként gyakorlatilag tiszta A 28695A és A 28695B antibiotikumot kapunk. Az amorf A 286 95A antibiotikumot meleg éterben oldjuk, majd kristályosítjuk. Így 11,8 g, 163—165 °C olvadáspontú kristályos, nátrium-és káliumsójának keverékéből álló A 28695A-t kapunk. Az A 28695B antibiotikumot szintén éterből kikristályosítva 5,3 g, 170—172 °C olvadáspontú, nátrium- és káliumsójának keverékéből álló A 28695B-t kapunk. 5. példa Az A 28695A-szabad sav előállítása Az A 28695A nátrium- és káliumsójából álló antibiotikum 5 grammját 105 ml dioxánban oldjuk. Az oldathoz 40 ml vizet adunk, pH-ját sósavval 4-re állítjuk be. Desztillációval eltávolítjuk a dioxánt, a desztillációs maradékként ka-8