166840. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikumok előállítására

166840 11 12 Az A 28695A és B antibiotikumok előállítására a fentiekben leírt mikroorganizmust többféle összetételű táptalajon tenyészthetjük, mert — mint ahogy az előzőekből kiderült — az organizmus különböző energiaforrásokat képes hasznosítani. A gazdaságos szintű termelés a legmagasabb antibiotikum-termelődési szint, az antibiotikum könnyű elkülönítése érdekében azonban előnyösen olyan táptalajt használunk, amely viszonylag egyszerű tápanyagforrásokat tartalmaz. A tenyésztő táptalaj tartalmazhat például olyan asszimilálható szénforrásokat, mint glükóz, mannit, fruktóz, oldódó keményítő, dextrin, melasz stb. Előnyösen azonban glükózt és dextrint használunk szénforrásként. Nitrogénforrásként használhatunk zabpelyhet, húskivonatot, hidrolizált kazeint, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, szójalisztet, peptonokat (hús vagy szója) stb. Nitrogénforrásként előnyösen szójalisztet és savval hidrolizált kazeint használunk. A táptalajba előnyösen ásványi sókat, például kalcium-, magnézium-, nátrium-, kálium-, kobalt-, klór-, szulfát- és karbonátionokra disszociáló sókat, növekedési faktorokat tartalmazó anyagokat, élesztőt vagy élesztőkivonatot keverünk. Ahogy sok más mikroorganizmus esetében, az NRRL 3883 jelű mikroorganizmus tenyésztésében is előnyös lehet az úgynevezett „nyomelemek" jelenléte. A nyomelemek általában a többi táptalaj-összetevővel együtt mint szennyezőanyagok kerülnek a táptalajba. Az A 28695 antibiotikumokat a mikroorganizmus növekedése szempontjából előnyös bármely hőmérsékleten tenyésztve előállíthatjuk, például 26 °C és 40 °C közötti, előnyösen 26 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten. A legtöbb antibiotikumot a tenyészlében a második és az ötödik nap között mérjük. A tenyésztő táptalaj pH-ja a fermentáció kezdetén nem meghatározó, előnyösen azonban 6,5 és 7,2 közé állítjuk be. Ahogy az más Actinomycetalesekkel is megfigyelhető, a táptalaj pH-ja a mikroorganizmus növekedésével együtt fokozatosan nő, 7,0 és 8,0 közötti vagy magasabb értéket érhet el. A tenyészlé végső pH-értéke, legalábbis részben, a fermentációs táptalaj kezdeti pH-értékétől, a táptalaj pufférkapacitásától és a fermentációs időtől függ. Rázott tenyészetben kis mennyiségű antibiotikum keletkezik. Nagy mennyiségű A 28695 antibiotikumok előállítására a termelő törzset előnyösen süllyesztett, aerob körülmények között, nagy térfogatú készülékben tenyésztjük. A fermentor jobb kihasználása érdekében célszerű a hosszú lag-fázis elkerülésére nem spórás, hanem vegetatív inokulumot használni. Ügy járunk el, hogy az organizmus spóráival viszonylag kis térfogatú táptalajt oltunk, és a fiatal, aktív vegetatív inokulummal oltjuk a hatóanyag termelésére indított főfermentort. A vegetatív inokulum táptalaja a főférmentáció táptalajához hasonló lehet, de előnyösen használhatunk más táptalajt is. A süllyesztett, aerob fermentációs eljárásoknál szokásos módon a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A termelő organizmus növekedése és az A 28695A és A 28695B antibiotikumok keletkezése szempontjából előnyösen a táptalaj egységnyi térfogatára számítva percenként 0,1 térfogatnál több levegőt buborékoltatunk át a táptalajon. A leggyorsabb növekedés akkor következik be, és a legtöbb antibiotikum! akkor termelődik, ha a táptalaj egységnyi térfogatára vonatkoztatva 0,3 térfogat levegőt vezetünk át a táptalajon. A tenyészlé hatóanyag-tartalmát a fermentáció közben biológiai értékméréssel követjük a szokásos módon. Az értékméréshez olyan tesztorganizmust használunk, amelynek növekedését az A 28695A és A 28695B antibiotikumok gátolják. Ilyen a Bacillus subtilis. A mérést a szokásos módon, zavarosságméréssel vagy agar-diffúziós módszerrel végezhetjük. Az A 28695A és A 28695B antibiotikumok elkülönítésére több eljárást használhatunk, például oldószeres extrakciót, abszorpciós, kromatográfiás megkötést. Ha az antibiotikumokat ke^ reskedelmi célra állítjuk elő, úgy előnyösen oldószeres extrakciót alkalmazunk, ugyanis ez az eljárás kevesebb időt igényel és kevésbé költséges, ugyanakkor így a kitermelési százalék is magasabb. A fermentáció során a hatóanyag egyrészt a. micéliumra abszorbeálódik, másrészt a tenyészlében oldódik. A hatóanyag elkülönítésére úgy járunk el, hogy a micéliumot szűrési segédanyag adagolása után szűréssel elválasztjuk a vizes oldattól, ez utóbbit pedig előnyös szerves oldószerrel extraháljuk. Ügy is eljárhatunk, hogy az egész tenyészlevet, szűrés nélkül, extrahaljuk.. Szerves oldószerként például etilacetátot, amilacetátot, butanolt, pentanolt, etanolt, metanolt vagy kloroformot használunk. Az antibiotikumot tartalmazó extraktumot csökkentett nyomáson, bepároljuk, így az A 28695 antibiotikumot olajos desztillációs maradékként kapjuk meg. Ez az^ antibiotikumot nátrium- és káliumsók keverékeként tartalmazza. Az antibiotikumok keverékének további tisztítását az olajos termék előnyös abszorbensen, például aktív szénen vagy szilikagélen való kromatografálásával végezzük. Az A 28695 antibiotikumok keverékének tisztítását előnyösen aktív szén abszorbensen, például „Pittsburg Carbon" kromatografáló oszlopon végezzük. A keverékből az egyes antibiotikumokat további kromatografálással kapjuk meg. így például, az A 28695A és B antibiotikumok nátrium-és káliumsóinak keverékét benzol és etilacetát 9:1 arányú elegyében oldjuk és az oldatot szilikagél oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást hasonló oldószereleggyel végezzük, miközben több frakciót különítünk el. A hatóanyag megjelenését a frakciókban vékonyréteg-kromatográfiával vagy papírkromatográfiával ellenőrizzük.. Az azonos antibiotikumokat tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószert desztillációval eltávolítjuk, amikor desztillációs maradékként az: elkülönített antibiotikumok (A és B) nátrium- és. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6