166802. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-tripszin-inhibitor tisztítására és dúsítására

MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1972. IV. 24. (BA—2737) Német Szövetségi Köztársaság-beli elsőbbsége: 1971. IV. 24. (P 21 20 088.4) A közzététel napja: 1975. I. 28. Megjelent: 1976. VII. 31. 166802 Nemzetközi osztályozás: C 07 g 7/00, 7/026 V )) Feltaláló: Gölker Christian vegyész, Wuppertal-Elberfeld, Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Bayer, AG., Leverkusen, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás kallikrein-tripszin-inhibitor tisztítására és dúsítására A találmány tárgya eljárás kallikrein-tripszininhibitornak szarvasmarha szervekből nyert oldataiból történő tisztítására és dúsítására amfoter ioncserélő gyantán történő megkötés útján oly módon, hogy a kallikrein-tripszin-inhibitor nyers oldatait 5 polistirol-alapú amfoter ioncserélő-gyantán adszorbeáltatjuk, a nem adszorbeálódó anyagokat pufferoldatokkal vagy sóoldatokkal történő mosással eltávolítjuk, ezt követően lineáris koncentráció-fokozatú sóoldattal a kallikrein-tripszin-inhibitort elu- 10 áljuk, az egyesített aktív frakciókat önmagában ismert módon sómentesítjük és az oldatot liofilizáljuk. Kallikrein-tripszin-inhibitornak szarvasmarhaszervekből, például parotisbol vagy tüdőből történő 15 extrakciójára számos eljárás ismert. A szervek feltárása savakkal vagy szerves, vízzel elegyedő oldószerekkel, előnyösen metanollal és alkáli- vagy földalkálifémek különböző sóival történhet (1 084 433 és 1 148 352 számú NSZK-beli szabadalmi leírások). 20 A hatóanyag további tisztítása például acetonnal (1 084 433 számú NSZK-beli szabadalmi leírás), ammóniurnszulfáttal (Biochem. J. 54, 257 [1953], vagy más sókkal történő leválasztással megy végbe. 25 Az utóbbi időben néhány olyan eljárás vált ismertté, amely a kaUikrein-tripszin-inhibitor (KTI) finom-tisztítását oszlopkromatográfiás eljárással folytatja le. Ennél az eljárásnál a DEAE- és CM-ceüulóz kromatográfiát alkalmazzák (Collection 30 Czech. Chem. Commun. 30,1705 [1965]; C. R. Acad. Se. Paris, 260, 3491 [1965]). A C. A. 70, 90.733 p térhálósított vér-protein-koagulációk előállítására vonatkozik oly módon, hogy a KTI-t di- vagy polikarbonsavas imidésztereivel reagáltatják. A C. A. 71,19.031 y ismerteti a KTI megkötődését polianionos hordozóanyagokon. Ezek a hordozóanyagok specifikusan megkötik a tripszint, kimotripszint, plazmint és kallikreint és így alkalmazhatók ezen anyagok dúsítására. A KTÍ-gyanta megkötőképességének növelésére a hordozóanyag negatív töltésének egy részét bázikus csoportok bevitelével semlegesítik, és így poliamfoter inhibitorgyanta keletkezik, amit azonban nem használnak a KTI tisztítására. A C. A. 70. 84,541 h referátum a KTI izolálására vonatkozik, enzimgyantára (tripszin-gyantára) történő megkötés útján. A kallikrein-tripszin-inhibitort, mint erősen bázikus polipeptidet, savas ioncserélők megkötik. Azt találtuk, hogy a kallikrein-tripszin-inhibitor megkötése polistirol-alapú amfoter ioncserélőn rendkívül erős és szelektív. Ez a megállapítás különösen áll az olyan polistirol-alapú amfoter ioncserélőkre, amelyek aminoecetsav-csoportokat és/vagy iminodiecetsav-csoportokat hordoznak. A kallikreintripszin-inhibitor-oldatok szennyező anyagai esetében ilyen erős és szelektív adszorpció nem lép fel. A találmány szerinti eljárás alkalmas tehát kallik-166802