166799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás BM123alfa,béta és gamma-antibiotikumok előállítására
166799 15 16 4 liter vízzel mossuk, és 0,3 n kénsavoldattal fentiek szerint eluáljuk. A hatóanyagot tartalmazó 1—7 frakciókat egyesítjük, az oldat pH-ját báriumhidroxiddal 7,0-re állítjuk. Az elegyet leszűrve 2,9 liter tiszta oldatot kapunk. Ezt vákuumban 75 ml-re 5 betöményítjük, majd szénen kromatografáljuk. 1 liter granulált Darco G—60 (0,4-0 ' 8 mm szemcseméretű) szenet vízben szuszpendálunk, majd üvegoszlopba visszük és ülepítjük. A víz feleslegét leszívatjuk, majd a 75 ml fenti koncentratumot las- 10 san az oszlopra visszük. Az oszlopot 4 liter vízzel mossuk, majd 3,5 liter 50%-os vizes metanollal eluáljuk. 50 ml-es frakciókat fogunk fel. A hatóanyagot tartalmazó 18—60 frakciókat egyesítjük, vákuumban betöményítjük, majd liofilizáljuk. 6,4 g 15 fehér színű szilárd BM123oc-t kapunk. A szénoszlopot ezután 50%-os vizes metanollal (kénsavvá] a vizes metanol pH-ját 1,8-re állítjuk) eluáljuk. 16 frakciót fogunk fel. A frakciókat egyesítjük, vákuumban betöményítjük. A vizes fázis pH-ját bá- 20 riumhidroxiddal 7,2-re állítjuk. Az oldatot leszűrjük, majd liofilizáljuk. További 1,5 g BM123oc-t kapunk. A szilárd anyagokat egyesítjük. Vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat alapján a kapott anyag x1 és « 2 elegyének mutatkozott. A BM123oc-t 25 Abderhalden-készülékben forrásban levő etanol fölött 16 óra hosszat szárítjuk, majd mikroanalízist végzünk. A kapott BM123oc nem mutat éles olvadáspontot. 200 °C körül fokozatosan elbomlik. A vizsgálat ered- 30 menye az alábbi: C: 33,89%; H: 5,7%; N: 11,88%; 0 (közvetlen): 35,40%; hamu: 0%. A BM123oc ultraibolya spektrumát 90%-os metanolos oldatban 200 y/ml koncentrációban vizsgálva 220 és 340 nm között abszorpciót nem észlel- 35 tünk. Specifikus forgatóképessége [x] 25 = +52,0 (C = 1,0 vízben). A BM123« infravörös spektruma az alábbi hullámhosszaknál mutat maximumot: 780, 815, 950, 1050,1110,1250,1340,1395,1560,1670, 1705, 2950 40 és 3330 cm-1. Az infravörös spektrumot KBr tablettában vettük fel. A spektrumot az 1. ábra mutatja be. 4. példa 45 BM123x és BM123y fermentációja NRRL 5646 Norcardia sp-vel dextróz 10,0 g 50 marhahúskivonat 4,0 g Bacto-pepton 4,0 g nátriumklorid 2,5 g élesztőkivonat 1,0 g víz ad 1000 ml 55 A táptalaj pH-ját nátriumhidroxiddal 7,0-re állítjuk. A táptalajt 120 °C-on sterilezzük. A sterilezést 9 kg nyomáson 60 percig gőzzel végezzük. A sterilezett táptalaj pH-ja: 6,7. Az 1. példa szerinti elő- 60 állított 150 liter inokulummal oltjuk le a 2000 literes fermentorban levő 1350 liter steril táptalajt. A fermentációt 28 °C-on végezzük. Habzásgátló szerként disznózsírolajat alkalmazunk. A levegőztetéshez a táptalaj 1 literére vonatkoztatva percenként 0,4 liter 65 levegőt használunk fel. A táptalaj keverését 50 ford./perc sebességgel végezzük. A fermentációt 85 óráig folytatjuk, majd a biomasszát leszűrjük. 5. példa BM123x és BM123x elkülönítése A 4. példa szerint előállított biomasszát 1% diatómaföld alkalmazásával szűrjük. A szűrőlepényt 50 liter vízzel mossuk. A szűrletet a mosóvízzel egyesítjük, majd 10 liter ágytérfogatú IRC 50 (Na+) gyantán szűrjük át. Átfolyási sebesség 330 ml/perc. Az oszlopot ezt követően 30 liter vízzel mossuk át. A hatóanyagot 170 liter 0,3 n kénsavoldattal eluáljuk. Az eluátumot két részletben fogjuk fel. Az első részlet a 7 és 5 pH-jú részeket tartalmazza. Ezt az első 45 literes részletet magas sótartalma miatt nem használjuk fel. A második részlet (120 liter) pH-ja 1,4. Az oldat pH-ját báriumhidroxiddal 6,5-re állítjuk. A báriumszulfátot 1 kg diatómaföld alkalmazásával leszűrjük. A szűrőlepényt 5 liter vízzel mossuk. A mosófolyadékot a szűrlettel egyesítjük ós vákuumban 2 literre bepároljuk. A koncentratumot 50 °C-os vízfürdőn melegítjük, majd forró Reinecke sóoldathoz adjuk (150 g/1500 ml víz; 75 °C). A forró oldatot szobahőmérsékleten tartjuk 48 óra hosszat. A keletkező vörös színű csapadékot 600 ml vízzel mossuk. A szilárd anyagot 2 liter víz és 5 liter butanol elegyével elkeverjük; az elegy pH-ját 0,25 n kénsavoldattal 1,5-re állítjuk. Az elegyet leszűrjük, a vizes fázist elkülönítjük, báriumhidroxid segítségével a pH-t 6,5-re állítjuk. Az elegyet szűrjük, majd vákuumban 350 ml-re betöményítjük. A koncentratumot 100 ml Dowex 1—x4 (Cl~) gyantát tartalmazó oszlopon engedjük át, majd liofilizáljuk. 50 g terméket kapunk. 90%-os fenol-kloroform-piridin-ecetsav-víz 1500: : 300 : 45 : 45 : 750 elegyét készítjük el. Az elegy felső fázisából 200 ml-t kiveszünk, majd ezt 250 g cellulózporral elkeverjük. A megnedvesített cellulózport 3,7 cm átmérőjű üvegoszlopba töltjük. Az oszlopra 16 ml fenti oldószerelegy felső fázisában oldott 10 g liofüizált termék és 20 g cellulózpor elegyét visszük. Az oszlopra 1,5 kg/6,5 cm2 nyomást adunk. Hetvenöt 25 ml-es frakciót fogunk fel. A hatóanyag ellenőrzését bioautográfiával végezzük. A vizsgálathoz feleseppentett papírkorongokat alkalmazunk. A korongokra cseppentett anyagot levegőn szárítjuk, éterrel mossuk, majd AD K. pneumoniae törzzsel fertőzött agarlemezre helyezzük. Két hatóanyagsávot mutathatunk ki. A BM123flc-hoz tartozó sáv a 3—18 frakcióból mutatható ki. A BM123/3-nak tulajdonítható második sáv a 31—52 frakcióból mutatható ki. A 3—18 frakciókat egyesítjük és 1400 ml kloroformmal kirázzuk. Az alsó fázist elkülönítjük; a felső fázis pH-ját 4,5-re állítjuk, és azonos térfogatú éterrel kétszer kirázzuk. Ily módon a maradék fenolt eltávolítjuk. A vizes fázis pH-ját IR 45 (OH~) gyantát alkalmazva 6,5-re állítjuk, majd az oldatot liofilizáljuk. 1,62 g BM123y-t kapunk. A 31—52 frakciókat egyesítve és a fentiek szerint eljárva 1,05 g BM123/?-t kapunk. 8
