166686. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, hipokalcémiás hatású dotriakontapeptidamidok előállítására

166686 69 70 forgó bepárlón 40° fürdőhőmérsékleten bepároljuk, n­oktanol hozzáadásával, a bepárlás maradékát az n­oktanol eltávolítására petröléterrel mossuk, 40°-on szárítjuk, vízben oldjuk és liofilizáljuk. Az Abu8-kal­citonin M acetátot teljesen színtelen, könnyű porként kapjuk. Vékonyrétegkromatogramon: Rre2 =0,42 és Rpjj = 0,61 (alumíniumoxid) és Rf45 = 0,53 (cellulóz). A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk elő: 2,0 g BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys­-Abu-Leu-Gly-OH vegyületet, 3,2 g H-Thr(tBu)-Tyr­(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp-(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)­-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly­-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet és 500 mg N-hidroxi­-szukcinimidet 35 ml dimetilformamidhoz adunk. Ezután keverés közben 600 mg diciklohexilkarbodiimid 5 ml dimetilformamidos oldatát csepegtetjük hozzá, és további 4 órán át 45°-on keverjük. Ezután 0°-ra hűtjük és a reakcióelegyet 600 ml éterben felvesszük. 3 órán át 0°-on állni hagyjuk, majd leszívatjuk és a nyers terméket vákuumban 35°-on szárítjuk. Tisztítás céljából metanolt adunk hozzá, a kevés diciklohexilkarbamidot leszűrjük, és metanollal készített Sephadex LH—20 oszlopon (4,8 cm; 120 cm) kromatografáljuk. 20 ml frakciókat szedünk, szárazra pároljuk és tisztaságukat szilikagéles lemezeken végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat­tal ellenőrizzük, 52A és 100 rendszerben. A tiszta frak­ciókat egyesítjük. A kiindulási anyagként alkalmazott dekapeptid­származékot pl. a következőképpen állítjuk elő: Z-Abu-OH vegyületet a vegyes anhidrid módszerrel (pivaloilkloriddal alkotott vegyes anhidrid) H-Leu-Gly­-OMe vegyülettel kondenzálunk, a szilikagéles kroma­tográfiával tisztított Z-Abu-Leu-Gly-OMe tripeptid­származékot H-Abu-Leu-Gly-OMe-vé hidrogénezzük és hasonlóan járunk el, mint az 1 287 601 számú nagy­britanniai szabadalmi leírásban a H-Met-Leu-Gly-OMe vegyületnél leírtak (1. példa, 9—18. pontban). 6. példa H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Thr­-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro­-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-AIa-Pro-NH2 . acetát (Val8-kalcitonin M. acetát) 12 mg H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly­-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe­-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyü­letet 10 ml vízben oldunk, a kapott vizes oldat pH-ját 2 n vizes ammóniumhidroxidoldattal 6,5-re állítjuk, és az oldaton addig vezetünk át levegőt, míg a nitro­prusszid-nátrium reakció nem mutat ki több szabad —SH csoportot. Ezután az oldatot híg ecetsavoldattal pH 4 értékre savanyítjuk, és liofilizáljuk. A maradékból az ammóniumacetátot 40°-on és 0,01 Hgmm nyomáson eltávolítva tiszta Val8-kalcitonin M-acetátot kapunk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizs­gálat alapján Rf52 = 0,53, Rf45 = 0,42. A kiindulási anyagot a következőképpen állíthatjuk elő: 1. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)­Cys(TRI)-Val-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr­(tBu)-Gm-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His­-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val­-Gly-Ala-Pro-NH2 30 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr­(tBu)-Cys(TRD-Val-Leu-Gly-OH, 10 mg N-hidroxi­szukcinimid, 50 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu>Thr(tBu)-Gln­-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOG)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe­-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2és 1 ml dimetilformamid elegyét 1 órán át 50° hőmérsékle­ten keverjük. Ezután az oldathoz 15 mg diciklohexilkar­bodiimid 0,2 ml dimetilformamiddal készített oldatát adjuk és 6 órán át 40—45° hőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet 15 ml éterben felvesszük, 5 órán át 0°-on állni hagyjuk és a csapadékot leszűrjük. Tisztítás céljából a szárított, finoman porított nyers terméket 3 ml jéghideg metanolban szuszpendáljuk, 2 órán át keverjük, és a rosszul oldódó védett dotriakontapeptidpt lecentrifugáljuk. Az eljárást megismételjük, majd a tisz­tított dotriakontapeptidet vákuumexszikkátorban kal­ciumklprid felett szárítjuk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizs­gálat során Rfl00 =0,54, Rre2A =0,61. 2. H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly­-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr­-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2. acetát 19 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr­(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr (tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gly-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala­-Pro-NH2 vegyületet 0,3 ml 96%-os trifluorecetsavban oldunk és 60 percig 25°-on állni hagyjuk. Ezután az ele­gyet 0°-ra hűtjük és 10 ml víz és 3 ml piridin jéggel hűtött elegyébe öntjük. A kapott reakcióelegyet nitrogénat­moszférában szűrjük, a vizes fázist 10 ml etilacetáttal mossuk, 0,5 ml ecetsavat adunk hozzá és nitrogén­atmoszféráhan Merck-II ioncserélővel (enyhén bázikus, acetátciklusú) töltött oszlopon szűrjük. Az eluátumot 40° fürdőhőmérsékleten forgó bepárlóban szárazra pá­roljuk és a maradékból a piridinacetátot 40°-on, és 0,01 Hgmm nyomáson történő szárítással távolítjuk el. A BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser-(tBu)-Thr(tBu)­-Cys(TRI)-Val-Leu-Gly-OH a 4. példában leírt, meg­felelő Nva8 -származékkal azonos módon állítható elő, oly módon, hogy Z-Val-OH vegyületet a vegyes anhid­rid-módszer szerint (vegyes anhidrid pivaloilkloriddal) H-Leu-Gly-OMe vegyülettel kondenzálunk, a kapott Z-Val-Leu-Gly-OMe vegyületet katalitikus hidrogéne­zéssel H-Val-Leu-Gly-OMe vegyületté alakítjuk, majd a 4. példa 3—7. pontjában ismertetettek szerint járunk el. 7. példa A következő komponensekből készítünk szuszpenziót: Val8 -kalcitonin M 1,0 mg ZnCl2 5,25 mg Na2 HP0 4 .2H 2 0 1,05 mg 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ! 35

Next

/
  • Elrendezés
  • Igazítás
  • Forgatás
Oldalképek
Tartalom