166650. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lipáz előállítására mikrobiológiai úton

7 166650 8 Miként az alábbi 2. táblázatból kitűnik, a találmány szerinti eljárással készített lipázt különböző fémionok inhibeálják. 2. táblázat Fémionok (10-s

g-ion/liter) Az inhibeálás mértéke Fe++, Fe+ + +, K+, Na+, Pb+ + , Co+ + , Mn++, Sn++, Sn+ + +

, Ba+ + Ca+ + 10% alatt Zn++, A1+ + + .NÍ+ + , Mg+ + 10—20% Cu + ,Cu+ + , Hg+ + 20% fölött Az alábbiakban a találmány megértése érdekében az oltalmi kör korlátozása nélkül kiviteli példákat adunk meg. A lipáz hatóértékét a következő módon határoztuk meg: I. Mérési mód (olívaolaj szubsztrátum) a) A reakcióelegy összetétele: enzim-oldat 1 ml 0,1 mólos foszfát-puffer pH =7,0 5 ml olívaolaj-emulzió 10 ml Az olívaolaj-emulziót úgy állítottuk elő, hogy 80 ml 2%-os vizes polivinilalkohol-oldathoz 20 ml gyógyszerkönyvi tisztaságú olívaolajat adtunk, és a folyékony keveréket homogenizálás céljából 5—10 C°-on 11000 ford/perc sebességgel 10 percen át centrifugáltuk. b) Művelet: A reakciót kb. 37 C°-on 50 percen át folytattuk le, és az emulzió-szerkezet megbontása érdekében a teljesen lereagált folyadékhoz 30 ml 1:1 arányú etanol-aceton elegyet adtunk. Ezután titrálást végeztünk 0,05 n NaOH-oldattal; indikátorként 1%-os fenolftalein-oldatot használtunk. Hasonló műveletet végeztünk különállóan is, előzetesen 100 C°-on 10 percen át kezelt denaturált enzimet használva. Az előző titrálási értékekből az utóbbi értékeket levontuk, és a maradék értéket ml-ben kifejezve használtuk a titer meghatározására (így 1 ml egy egységet jelent). II. Mérési mód (disznózsír szubsztrátum) a) A reakcióelegy összetétele: enzim-oldat 1 ml pH 7,0 0,1 mólos foszfát-puffer 5 ml disznózsír-emulzió 10 ml hasonló eljárást végeztünk olyan denaturált enzimmel, amelyet előzőleg 10 percen át 100 C°-on melegítettünk. Az eljárás további része megegyezett a fentivel. 1. példa 100 ml olyan folyékony tápoldatot (pH = 6,5), amely 2% disznózsírt, 2% keményítőt, 2% portalanított és zsírtalanított szójababot, 0,3% ammóniumszulfátot, 0,2% kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,5% kalciumkarbonátot, 0,1% magnéziumszulfát-heptahidrátot és a fennmaradó részben vizet tartalmazott, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltöttünk, és 120 C°-on 20 percen át gőzzel sterilizáltuk. Ezután a folyékony tápoldatot beoltottuk Chromobactérium viscosum var. paralipolyticum FERM—P No. 137-tel, és folytonos keverés mellett 26 C°-on 4 napon át tenyésztettük. A keveréshez 300 fordulatszámú körrázógépet használtunk. A micéliumot elkülönítettük a tenyészoldattól, és 75 ml szűrletet kaptunk, amelyet lipáz hatásának tettünk ki. A lipáz aktivitása a fentebbi II. módszerrel mérve 11,5 egység/ml volt. A tenyészoldat szűrletéhez ezután etanolt adtunk 75% alkohol-koncentráció eléréséig. Ilyen módon 3,43 g nyers lipáz-port kaptunk, amely gyenge proteáz-aktivitást mutatott, azonban nem adott oc-amiláz-, ß-amilaz- és lipoprotein-aktivitást. 2. példa Mindenben az 1. példa szerinti módon jártunk el, azzal az eltéréssel, hogy disznózsírt nem használtunk. Ilyen módon 26 g nyers lipáz-port kaptunk (hatóanyagtartalma: 15 egység/g). 3. példa Mindenben az 1. példa szerinti módon jártunk el, azonban disznózsír helyett olívaolajat használtunk. Ilyen módon 3,01 g nyers lipáz-port kaptunk. A nyers lipáz aktivitása az I. mérési mód szerint 109 egység volt. 4. példa Mindenben az 1. példa szerinti módon jártunk el, azonban disznózsír helyett szójaolajat használtunk. A kapott por aktivitását az I. mérési módszerrel 100 egység/g-nak találtuk. 5. példa 20 1 olyan folyékony közeget (pH =6,5), amely 2% disznózsírt, 2% keményítőt, 2% porított és zsírtalanított szójababot, 0,3% ammóniumszulfátot, 0,2% káliumdihidrogénfoszfátot, 0,5% kalciumkarbonátot, 0,1% magnéziumszulfát-heptahidrátot és habzásgátló anyagot (a Nippon Yushi Co. Limited cég által gyártott „Disform CA 220" elnevezésű anyag) tartalmazott, 30 ml űrtartalmú fermentorba mértünk be, majd 30 percen át 120 C°-os gőzzel sterilizáltuk. Az utóbbi emulziót úgy készítettük, hogy hőhatással megolvasztott 20 g disznózsírhoz 10 ml Tween 60-at 55 és 70 ml vizet adtunk, és 11 000 ford/perc sebességgel homogenizálás céljából centrifugáltuk. b) Művelet: A reakciófolyadékot L-alakú kémcsőbe töltöttük, amelyet azután Monod-féle rázógéppel 40 C°-on 60 per- 60 cen át ráztunk. A reakció febejeződésekor a reakcióelegyhez 30 ml 1:1 arányú etanol-aceton elegyet adtunk, hogy az lerombolja az emulzió vázszerkezetét. Ezután a titrálást 0,05 n NaOH-oldattal végeztük, 1%-os fenolftalein-oldat indikátor használata mellett. Külön 65 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4