166551. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimek kinyerésére és tisztítására szintetikus polimerekkel (kopolimerekkel) történő kicsapás révén

7 166551 7 Kitermelés: alfa-amiláz 95% neutrális proteáz 70% A 3,2 kg száraz enzimport 10 liter 0,3 mólos, pH 9,5-ös ammóniumhidroxid-ammóniumkloridos pufferoldatba szórjuk kis részletekben, állandó keverés közben 0 C°-on. Az oldhatatlan maradékot kiszűrjük, majd súlyára számított háromszoros mennyiségű acetonba keverjük szintén 0 C° hőmérsékleten. Szűrés után vákuum szárítószekrényben szobahőmérsékleten szárítjuk (I. sz. por). Az oldhatatlan csapadék szűrletéből 0 C°-on a szűrlettel azonos térfogatú 96%-os etanollal kicsapjuk a II. sz. port, melyet szintén kiszűrünk és szárítunk. Ennek a szűrletéből kétszeres térfogatú 96%-os etanol hozzáadásával a III. sz. port csapjuk ki (frakcionált kicsapás). Ezt is kiszűrjük, vákuumszárítószekrényben szobahőmérsékleten szárítjuk. Por súlya kg Alfa-amiláz Neutrális pro teáz Por súlya kg specifikus aktivitás I. sz. por II. sz. por III. sz. por 2,72 0,296 0,12 SKBe/g 5 520 24 200 57 800 PUK/g 1 140 1201 31750 Kiindulási anyagnak a 3,2 kg száraz port tekintve a kitermelés: alfa-amiláz 94% neutrális proteáz 86% Fermentiere számítva a kitermelés: alfa-amiláz 89,5% neutrális proteáz 60,0% Amennyiben magas aktivitású csíraszegény enzimet kívánunk előállítani, az ammóniumhidroxidos-ammóniumkloridos puffer oldatot az etanolos kicsapás előtt sterilre szűrjük. 4. Bacillus subtilis 24 órás tenyészetének kálciumfoszfátgélen történő szűrésével, 400 SKBe/ml alfa-amiláz és 167 PUK/ml neutrális pro teáz tartalmú szűrletet kapunk. 100 liter szűrletet, amelynek szabad kalcium tartalma 1,8 mg/ml-nél nem magasabb, keverővel ellátott duplafalú készülékbe szívatunk, majd keverés és hűtés közben 0 C°-on 5 liter 10%-os vizes polimetakrilsav-oldatot adagolunk hozzá. Ekkor a pH 4,5—4,2 értékek közé áll be és az enzimek kiválása megtörténik. A csapadékot kb. 30 percig zsugorodni hagyjuk, majd a kialakult enzim-polimer-komplexet szűrjük. 1,5 kg kb. 40% víztartalmú csapadékot kapunk, melyet hűtés közben 0 C°-on 7,5 liter 1% nátriumszulfátot tartalmazó technikai acetonba keverünk, majd leszűrjük és vákuum szárítószekrényben, szobahőmérsékleten szárítjuk. A kapott termék súlya 0,5 kg. Specifikus aktivitása: alfa-amiláz 60 000 SKBe/g neutrális proteáz 20 000 PUK/g A szűrt fermentiere vonatkoztatott kitermelés: alfa-amiláz 75% neutrális proteáz 60% 5. A fermentlé szűrése és az enzimek kicsapása a 4. példa szerint történik. A kapott 1,5 kg nedves enzim-polimer-komplex csapadékot 5 liter 1 mólos nátriumhidrogénkarbonát oldatban vesszük fel, majd 0 C°-on állandó keverés közben 15 liter 0 C°-os technikai acetonnak kicsapjuk az enzimeket. Vákuumban szűrjük, majd szobahőmérsékleten, szárítószekrényben szárítjuk a csa-5 padékot. A kapott termék súlya 0,420 kg. Specifikus aktivitása : alfa-amiláz 70 000 SKBe/g neutrális proteáz 25 000 PUK/g A szűrt fermentiere vonatkoztatott kitermelés: 10 alfa-amiláz 72% neutrális proteáz 63% 6. Bacillus subtilis alkalikus proteáz tartalmú fermentlevet szűrünk. A szűrlet aktivitása 106 PUK/ml. 100 liter szűrletet 0 C°-ra hűtünk, majd 0,5 súly/tf.% 15% stirol 15 tartalmú 20 000 átlag-molekulasúlyú stirol-akrilsav kopolimerrel(10 súly/térfogatszázalékos oldatban, n. nátriumhidroxidban oldva) kicsapjuk az enzimet, a pH-t 2,0 mólos 3,6 pH-jú nátriumacetát-ecetsav pufferoldattal 4,5-re állítjuk, majd kb. 30 perc keverés után az enzim-20 -kopolimer-komplexet vákuum-szűrőn szűrjük. A kapott 1,45 kg nedves csapadékot 0 C°-on 4,35 liter technikai izopropanolba keverjük, majd a szuszpenziót szűrjük és az enzimet vákuum szárítószekrényben, szobahőmérsékleten szárítjuk. A kapott termék súlya 0,770 kg. 25 Specifikus aktivitása: 11 750 PUK/g. Kitermelés: 85% a fermentiere vonatkoztatva. 30 7. Streptomyces fradiaé proteáz tartalmú fermentlevet 0,5 súly/térfogatszázalék kalciumkloriddal keverünk félórán át, majd szűrés után a 100 liter, 280 PUK/ml proteáz tartalmú folyadékhoz keverővel ellátott készülékben, erőteljes keverés közben 0,5 súly/térfogatszáza-35 lék 15% stirol tartalmú, 20 000 átlag-molekulasúlyú stirol-akrilsav kopolimert adagolunk (10 súly/térfogatszázalékos oldatban, n. nátriumhidroxidban oldva), a pH értéket 2,0 mólos 3,6 pH-jú nátriumacetátecetsav pufferoldattal 4,8-ra állítjuk, majd 30 perc keverés után 40 az enzim-kopolimer-komplexet vákuum dobszűrőn szűrjük. A kapott 1,62 kg nedves csapadékot 0 C° hőmérsékleten, 4,86 liter technikai metanolba adagoljuk, 10 percig kevertetünk, majd a szuszpenziót szűrve, a csapadékot vákuum szárítószekrényben szobahőmér-45 sékleten szárítjuk. Kitermelés a szűrt fermentiere vonatkoztatva: 80%. A kapott termék súlya 350 g. Specifikus aktivitása: 64 000 PUK/g. 8. Bacillus subtilis fermentlé szűrése és az enzimek 50 kicsapása a 4. példa szerint történik. A kapott 1,5 kg nedves enzim-polimer-komplex csapadékot 5 liter 0,06 mólos nátriumhidrogénkarbonát oldatba vesszük fel, majd 0—12 C° hőmérsékleten, állandó keverés mellett 2,5 kg ammóniumszulfáttal csapjuk ki az enzimeket. 55 A csapadékot vákuum szűrőn szűrjük, majd vákuumszárítószekrényben szobahőmérsékleten (18—22 C°) szárítjuk. A kapott termék súlya 1,05 kg. A termék specifikusaktivitása: alfa-amiláz 23 250 SKBe/g 60 neutrális proteáz 10 000 PUK/g. A szűrt fermentiere vonatkoztatott kitermelés: alfa-amiláz 71,8% neutrális proteáz 83,0% 9. Bacillus subtilis fermentlé szűrése és az enzimek ki-65 csapása a 4. példa szerint történik. A kapott 1,5 kg 4