166526. lajstromszámú szabadalom • Emberi epiteliális, heterploid májsejtvonal

3 166526 4 nak elő vakcinációs és diagnosztikai célra. A jelen találmány egyik célja volt ilyen sejtvonal létrehozása, és pedig humán epiteliális májsejtvonalé, mely glikogént tartalmaz és mind morfológialilag, mind biokémiai aktivitásban az in vivo, működő máj sejtekhez hasonló. Találmányunk, mint említettük, olyan humán epiteliális heteroploid máj sejtvonalakra vonatkozik, mely tenyésztő folyadékban különálló szigeteket és elkülönülő rögöket alkot, amely morfológiailag hasonló az emberi máj hepatocitáihoz, generációs ideje nem haladja meg a 24 órát, glikogén-termelése legalább 50%-os növekedést mutat, ha a táptalajban körülbelül 1% glukóz van jelen, és vírusok szaporítására alkalmas. A tenyésztési eljárás kiindulási anyagául szolgáló WRL 68 sejtvonalat letétbe helyeztük az alábbi gyűjteményekben: Wellcome Collection of Microorganisms and Cultures, Beckenham, Kent, Anglia, illetve American Type Culture Collection at Rockville, Maryland USA (ATCC CL 48 számon). A találmány szerinti sejtvonal-típus heteroploid, azaz a tipikusan humán kromoszómák számának egy része nem diploid vagy abnormális, a mi esetünkben 63-tól 91-ig változik. A középérték 72 körül van. Mikroszkóp alatt a sejtek epitoloidok és poligonálisak, a hepatocitákhoz hasonlóak. A találmány szerinti sejtvonal, amelyet például emberi májsejtekből kiindulva fejlesztettünk ki, egy élő állatfaj tulajdonságaival rendelkezik. A Mayr által 1940-ben megállapított régi állatfaj definíció (Mayr, Linstey és Usingee; Methods and Principles of Systematic Zoology, McGraw-Hill, 1953, 24—25 old.) szerint „az (állat) faj a természetes populáció ténylegesen vagy potenciálisan egymás között szaporodó olyan csoportja, amely egyéb hasonló csoportoktól reproduktive izolált". Azóta azonban fölismerték, hogy ez a definíció nem említi az időleges szekvenciális fajokat, az egy-szülőjű szervezetek jól ismert típusait. Ezért a modern definíciók elhagyják az egymás közötti szaporodást, mint esszenciális kritériumot, és a genetikus kapcsolatot vagy reprodukciós folyamat során a leszármazást hangsúlyozzák. Így Blackweicher N. E. (Taxonomy, I. Wiley and Sons, Inc 1967, 163, 164 és 354 oldal) kijelenti, hogy „a faj magában foglalja az összes közös öröklöttségű egyedet visszamenőleg addig a pontig, ahol az ősök már elég sok tulajdonságban különböznek ahhoz, hogy külön fajnak tekintsük őket". A szerző azt is kinyilvánítja, hogy lényegében lehetetlen egy fajt úgy definiálni általában, hogy a megfogalmazás az összes egyedi esetre érvényes legyen, de elismeri, hogy a faj tagjai azonos jellegűek és „hasonlóak, mind a leszármazottaikhoz, mind felmenő rokonaikhoz néhány generáción belül". G. G. Simpson fejtette ki a legfejlettebb és leginkább idevágó koncepciót (Principles of Animal Taxonomy, 1961, Oxford, Univ. Press, 147—155. old. és 161—163. old., valamint The Species Concept, Evolution, Vol, 285—298. old.). A faj fogalmát itt a megfelelő fejlődéstörténeti szempontból határozzák meg. Eszerint „a faj olyan leszármazás (populációk időrendi leszármazási egymásutánisága), amely másoktól eltérő fejlődéssel és saját fejlődéstörténeti szereppel és tendenciákkal rendelkezik." A szerep fogalma a környezethez való viszonnyal van kapcsolatban, azaz rendszerint azzal való jellegzetes kölcsönhatást és morfológiai tulajdonságokat jelent. A modern faj-fogalom ezen definíciója pontosan kö-5 veti Meglitsch elméletét (On the Nature of the Species, 1954, Systematic Zoology 3., 49. és 65. old.): „Egy-szülőjű és két-szülőjű szervezetek esetében a fajt definiálhatjuk olyan természetes populációként, amely lényegében egységet alkotva él, vagy meg-10 őrzi azt a képességét, hogy egységként fejlődjék, ha a mesterséges határokat eltávolították." A találmány szerinti sejtvonal uniparenterális organizmusként kielégíti a fenti kritériumokat és rendelkezik azokkal a tulajdonságokkal, amelyeket 15 ilyen szervezetektől általában elvárnak. A találmány jobb érthetősége kedvéért és a sejtek főbb tulajdonságaínak jobb felismerhetőségére példaképpen leírjuk a WRL 68 sejtvonal optikai és elektronmikroszkópiái megjelenéseit hivatkozással a 20 mellékelt ábrákra. Az 1. ábra egy különálló sejthalmaz képe, mely a mikroszkóp alatt látható legfőbb tulajdonságokat szemlélteti 2400-szoros nagyításban. A 2. ábra elektronmikroszkópos metszet képe 25 19 000-szeres nagyításban. Az 1. ábrán a C jelentése egyedi sejt, kerek magvakkal, N jelentése maximálisan 5 NL = nukleolust tartalmazó sejtmag. CP jelentése citoplazma, amely minden sejtmagot (N) körül vesz. 30 A 2. ábrán CP jelentése citoplazma, MB jelentése szemcse, mely valószínűleg lipoid anyagból áll, M jelentése mitokondrium, mely nagy számban van jelen, GL jelentése a szintén nagy mennyiségben jelenlevő glikogén. Az elektronmikroszkópos kép igen 35 hasonló a tipikus emberi hepatocitákhoz és nagymértékben eltér a fibroblaszt sejtek szokásos szerkezetétől. Azok a hasonló és lényegében azonos sejtvonalak, amelyeket a találmányban leírt sejtvonalak módosí-40 tásával vagy „klónozásával" előállíthat a szakmában jártas kutató anélkül, hogy lényegesen megváltoztatná a sejtvonal morfológiai, vagy funkcionális tulajdonságait, ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartoznak. Jóllehet a találmány szerinti sejtanyag — 45 mint arra utaltunk — bárkinek rendelkezésére áll, mégsem lehetetlen és valószínűtlen, hogy hasonló vagy funkcionálisan lényegileg azonos humán epiteliális heteroploid májsejtvonalat lehessen előállítani más módszerrel, vagy nem várt véletlen, de re-50 produkálható esemény folytán. Az ilyen funkcionálisan azonos sejtvonalak szintén a találmány hatálya alá esnek. A kiindulási sejtvonal WRL 68 teljesen váratlan és eredeti spontán transzformáció útján keletkezett, hu-55 mán embriószövet tripszínezése útján és azt Eagleféle minimális esszenciális táptalajon — 10% marhasavó jelenlétében — 37 °C-on több hónapon át tartva. [A táptalaj leírását lásd: Eagle H., Science, 130, 432, (1959).] 60 A sejtvonal jól növekedik (fejlődik) a standard táptalajokon. Legcélszerűbben a könnyen hozzáférhető, az Eagle-féle minimális esszenciális, vagy az Eagle-féle alap-táptalajok (lásd: Eagle H., J. Exp. Med. 102, 595, (1955)] alkalmazhatók. Ezek kiegé-65 szíthetők szokás szerint marhasavóval, vagy külö-2