166448. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polinukleotidfoszforiláz előállítására
3 166448 4 ves oldószerrel, így acetonnal vagy előnyösen valamely rövidszénláncú alkanollal, így metanollal, etanollal, izopropanollal és hasonlókkal; ekkor a PNFáz legnagyobb része elkülönül a vizes—szerves oldószeres oldattól. Maximális PNFáz lecsapás elérése céljából a keletkező vizes elegy optimális szerves oldószer koncentrációja metanol esetében körülbelül 30—80%, előnyösen 50%, izopropanol esetében körülbelül 30^-40% és etanol esetében körülbelül 35—45%, előnyösen 40%. Általában előnyös, ha a vizes PNFáz-oldat pH-ját körülbelül 8,0 értékre állítjuk be és 40% koncentrációban alkalmazunk alkoholt. A szerves oldószer és vizes PNFáz-oldat összekeverésekor keletkező szuszpenziót centrifugáljuk, így elkülönítjük a lecsapódott PNFáz-t. Ezt a PNFáz-t ezután feloldjuk 8,2 pH-értékű puffer-oldatban és az oldatot dialízisnek vetjük alá friss pufferrel szemben, így eltávolítjuk a visszamaradó ammóniumszulfátot. A keletkező pufferolt PNFáz-oldatot centrifugálással megtisztítjuk és fagyasztott állapotban tároljuk. Ez a PNFázoldat viszonylag mentes inhibitoroktól és fajlagos PNFáz aktivitása körülbelül 0,04—0,10 egység/mg protein. A találmány szerinti eljárással előállított enzimkészítményből kovalens kötésű enzimatikus katalizátor állítható elő, amely kitűnően alkalmazható polinukleotidok szintézisére és 30—40 alkalommal újra felhasználható polimerizálásra, mimellett a polinukleotidot tiszta állapotban, jó kitermeléssel kapjuk. így például, ha 20 polimerizáló ciklust valósítunk meg, az egyesített 1—9. frakció polinukleotid kitermelése körülbelül 25% és az egyesített 10—20 frakcióé körülbelül 20%. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg, amelyek az eljárás illusztrálására szolgálnak, az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa Táptalajt készítünk az alábbi összetevőkből: Difco élesztő extraktum 4670,0 g MgS04 . 7 H 2 0 186,8 g NaCl 9,3 g FeS04 . 7 H2 0 9,3 g MnS04 , 4 H 2 0 7,4 g NaHCOg 3969,6 g dextróz 9340,0 g Vízzel ezeket az összetevőket 467 1 térfogatra egészítjük ki. A fenti táptalajt sterilizáljuk és beoltjuk 1,5 1 Micrococcus lysodeikticus (M. luteus; ATTC No. 4698) kultúrával, amelyet 1,5 1 fenti táptalajon tenyésztettünk körülbelül 36 órán keresztül 28 C°-on. Az inokulált táptalajt ezután keverés és levegőztetés közben körülbelül 20 órán keresztül körülbelül 28 C° hőmérsékleten inkubáljuk, ennek az időtartamnak a végén a fermentált táptalaj optikai sűrűsége megközelítőleg 2,0. Ezután a fermentált táptalajt lassan körülbelül 0—5 C°-ra hűtjük, majd centrifugáljuk, miközben a hőmérsékletet körülbelül 5 C° alatt tartjuk. A centrifugáláshoz előnyösen Sharples centrifugát használunk, az átmenő teljesítmény körülbelül 3,78 l/perc. A felülúszó réteget eldobjuk és a hideg, körülbelül 1,5-—2,5 kg súlyú sejtpépet 0,5%-os jéghideg nátriumklorid-oldatban újra szuszpendáljuk, minden kg sejtpépre körülbelül 1 liter nátriumklorid-oldatot használva. A keletkező szuszpenzió hőmérsékletét körülbelül 0—5 C°-on tartjuk, keverés közben hozzáadunk 1 ml 2-merkapto-etanol antioxidánst, és a szuszpenziót fátyolszöveten átszűrjük; így 5 eltávolítjuk a csomókat, amelyeket újra feldolgozunk és visszaviszünk a szuszpenzióhoz. A keletkező szuszpenziót, amelyet minden művelet előtt körülbelül 0—5 C°-ra hűtünk, háromszor átviszszük körülbelül 540 at nyomáson egy homogenizálón, 10 így felszakítjuk a sejteket. Ezt a homogenizálást általában Laboratory Homogenizer segítségével valósítjuk meg (Model 15M50—8TBA, gyártja Manton—Gaulin Mfg. Co., Everett, Mass.). A homogenizált szuszpenziót ezután 40 percen keresztül 11000 g-vel centrifugáljuk 15 Sorvall hűtő-centrifugán; a visszamaradó szilárd anyagot, azaz a sejthulladékot eldobjuk és a tiszta felülúszó réteget, amelynek térfogata körülbelül 2000 ml, megfagyasztjuk. Ennek a felülúszó rétegnek a vizsgálata azt mutatja, hogy a protein-tartalom körülbelül 3,6 mg/ml 20 és a PNFáz aktivitás körülbelül 0,05 egység/ml, 0,014 egység PNFáz/mg protein. A megfagyasztott felülúszó réteg egy részét megolvasztjuk és szükség esetén centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk a kis mennyiségű elkülönült proteint. Ennek az 25 anyagnak körülbelül 130 ml-éhez, amely összesen körülbelül 24 egység PNFáz-t tartalmaz és amelyet 0—5 C°-ra hűtöttünk, keverés közben, lassan körülbelül 31 g szilárd ammóniumszulfátot adunk; a keletkező oldat ammóniumszulfát koncentrációja körülbelül 24%. A ke-30 letkező elegyet további 20 percen keresztül keverjük, majd körülbelül 30 percen keresztül 23000 g-vel centrifugáljuk. A lecsapódott szilárd anyagot, amely főképpen protein, eldobjuk (ebben a csapadékban körülbelül 4,9 egység PNFáz aktivitást vesztünk). Ez a centri-35 fugálási művelet, együttesen azzal a centrifugálással, amelyet, ha szükséges, az ammóniumszulfát adagolása előtt végeztünk, jelentős PNFáz aktivitásnövekedést eredményez, nyilvánvalóan az inhibitorok eltávolítása következtében. 40 A centrifugáláskor kapott, körülbelül 140 ml térfogatú felső réteghez keverés közben lassan körülbelül 75 ml BBA etanolt adunk, így a végső etanol koncentráció körülbelül 35%; így kicsapjuk a PNFáz-t. A keletkező vizes etanolos elegyet 0—5 C° hőmérsékleten körül-45 belül 20 percen keresztül keverjük, majd körülbelül 35 percen keresztül 23.000 g-vel centrifugáljuk; így kinyerjük a lecsapódott PNFáz-t. A felső réteget, amely körülbelül 3,5 PNFáz egység aktivitású, eldobjuk. A lecsapódott PNFáz-t kismennyiségű, körülbelül 50 15—20 ml hideg, körülbelül 5 C° hőmérsékletű PNFázpufferral tritúráljuk, amely az alábbi összetételű: 10 ml 1 mólos trisz-(hidroximetil)-aminometán, HCl oldat, 1 ml 1 mólos magnéziumacetát-oldat, 55 0,07 ml tioetanol. Ezeket az összetevőket üvegedényekben desztillált vízzel 1 liter össztérfogatra hozzuk és a puffer pH-ját 8,2 értékre állítjuk be. A keletkező oldatot ezután körülbelül 5 C° hőmérsék-60 léten körülbelül 15 órán keresztül dializáljuk friss PNFáz-pufferral szemben. A maradékot centrifugálással megtisztítjuk előnyösen Sorvall hűtő-centrifugát alkalmazva, miközben a hőmérsékletet körülbelül 0—5 C° hőmérsékleten tartjuk és a tiszta felső réteget üvegbe 65 töltjük, megfagyasztjuk és fagyasztott állapotban tárol-2
