166412. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikum előállítására
11 166412 12 elválasztjuk és a fentiekben megadott módon kezeljük azzal a változtatással, hogy nátriumdietil-malonáttal a pH-t 8,5-re állítjuk be. A második csapadékot savazzuk és friss butilacetáttal extraháljuk. Az extraktot Darco G—60-nal kezeljük és az X—5108 antibiotikum nátriumsóját nátrium-dietil-malonáttal pH 8,0 értéken kicsapjuk. A kapott sárga nátriumsó aktivitása mosás és szárítás után in vitro tesztben B. simplex ellen 430 egység/mg. A fent ismertetett extrakciós eljárást az alábbi folyamatábrán tüntetjük fel: /. lépés: 11 300 liter teljes fermentlé (5—6 napos fermentációs idő). A micéliumot Hyflo segítségével szűréssel eltávolítjuk. 2. lépés: 9800 liter szűrt fermentlé (pH 7,5). Szükség esetén a pH-t foszforsavval beállítjuk. 2300 liter butilacetáttal extraháljuk. 3. lépés: 2200 liter 1. butilacetát extrakt. 2 x94 liter vízzel mossuk, majd gyorsbepárolóban betöményítjük. 4. lépés: 300 liter „1. butilacetátos koncentrátum". A pH-t nátrium-dietil-malonáttal 9-re állítjuk be (kb. 1—1,5 liter 1,7 n reagens). A csapadékot szűrjük, 4 liter butilacetáttal mossuk. 5. lépés: 1. csapadék. 94 liter kénsavban oldjuk, a pH-t 15 %-os foszforsavval 4-re állítjuk be. Butilacetáttal kétszer extraháljuk (75 + 40 liter). 6. lépés: 102 liter 2. butilacetátos extrakt. 2x8 liter vízzel mossuk, majd gyorsbepárlóban bepároljuk. 7. lépés: 15 liter „2. butilacetátos koncentrátum". A pH-t nátrium-dietil-malonáttal 8,5-re állítjuk be, a csapadékot szűrjük és 4 liter butilacetáttal mossuk. 8. lépés: 2. csapadék. 76 liter Vízben oldjuk, a pH-t 15%-os foszforsavval 5-re állítjuk be, majd butilacetáttal kétszer extraháljuk (57 + 28 liter). 9. lépés: 79 liter 3. butilacetátos extrakt. 2x8 liter vízzel mossuk, majd gyorsbepárlóban betöményítjük. 10. lépés: 15 liter „3. butilacetátos koncentrátum". Szobahőmérsékleten 50 g Darco G—60-nal 1 órán át keverjük. Szűrjük és gyorsbepárlóban betöményítjük. 11. lépés: 8 liter 4. butilacetátos frakció. A pH-t nátrium-dietil-malonáttal 3,0-ra állítjuk be, a kiváló csapadékot szűrjük, 4 liter butilacetáttal, majd 4 liter petroléterrel (f. p. 30—60 C°) mossuk, 50—60 56 C°on 0,5 Hgmm nyomáson 36 órán át szárítjuk. Az X—5108 antibiotikum nátriumsója sárga amorf anyag. 3. példa Az X—5108 antibiotikum tisztítása ellenáramú extraktorban. Csövek száma — 200; a felső fázis térfogata — 40 ml; az alsó fázis térfogata — 40 ml. Berendezés: Craig-típusú ellenáramú megosztásos készülék. Beadagolás A nyers fermentlé oldószeres extrakciójától kapott 5 g X-^5108 antibiotikumot 40 ml felső fázisban oldjuk. Oldószer-rendszer Etilacetát, izopropanol és 0,1 mólos vizes szekunder nátriumfoszfát oldat 12: 9: 20 térfogat arányú elegye. 5 Megoszlási jellemzők Átmenetek száma — 200; 10 csúcs cső 200 átmenet után — 159; megoszlási hányados — 3,88. Eljárás. A 150—170. frakciót összegyűjtjük és az antibiotikumot 1-butanol hozzáadásával a szerves fázisba visszük át. A vizes fázist elöntjük és a szerves fázist víz-15 zel négyszer mossuk. A vizet a szerves fázisból azeotrop desztilláció segítségével eltávolítjuk és a terméket petroléter hozzáadásával kicsapjuk. 3 g antibiotikumot kapunk, melynek aktivitása a kiindulási anyagénak kb. kétszerese. 20 4. példa Az X—5108 antibiotikum tisztítása Sephadex LH-20--on történő kromatografálással 25 Az előző példa szerinti ellenáramú megoszlásos eljárással tisztított antibiotikum 300 mg-os mintájának etanolos oldatát nátriummetilát-oldattal pH-8—9 értékre állítjuk be (nedves indikátor papír), majd 290 x 41 mmes Sephadex LH-20 oszlopra visszük, melyet metanollal 30 denaturált etanollal egyensúlyozunk ki. Az oszlopot etanollal (mely metanollal denaturálva van) hívjuk elő, a fő antibiotikum zóna 950—1200 ml effluens térfogatnál jelentkezik. A következő frakciók elhanyagolható biológiai aktivitást mutató számos színes zónát tartal-50 máznak. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, kis térfogatra bepároljuk és az antibiotikumot éter és petroléter hozzáadásával kicsapjuk. A kapott sárga szilárd anyag az X—5108 antibiotikum nátriumsója, mely vékonyréteg-kromatográfiás úton egyetlen foltot ad; Rf = 0,19 40 (szilikagél F-254, kimutatás ultraibolya fénnyel), Rfra = 0,29 (szilikagél/kieselguhr, bioautográfiai kimutatás). 5. példa 45 Az X—5108 antibiotikum előállítása nátriumsójából Sephadex LH-20-on történő kromatografálással kapott 0,464 g X—5108 antibiotikum nátriumsót 4,6 liter jeges vízben és 10 ml etilacetátban oldunk; kétfázisú rendszer képződik. Az elegyhez választótölcsérben 1 ml 50 primer nátriumfoszfát-oldatot adunk (50 g NaH2 P0 4 • • H2 0 100 ml vízben). A kezdetben kiváló csapadékot rázogatás közben oldjuk. A vizes fázist elöntjük, a szerves fázist 4x1 térfogatrész jeges vízzel mossuk és etanol segítségével azeotrop desztillációval víztelenítjük. A kon-55 centrátumot (2 ml) 2 térfogatrész etilacetáttal hígítjuk és zavarosodásig dietilétert csepegtetünk be, majd 30 ml petrolétert adunk hozzá. A kiváló csapadékot szűrjük és szobahőmérsékleten szárítjuk. A kapott termék az X—5108 antibiotikum. 6. példa Az X—5108 antibiotikum növekedésserkentő hatá« 65 sának vizsgálata 6
