166365. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oxigéntartalmú vizes oldatban lévő eltérő koncentráciíjú anyagok kvantatív meghatározására

3 166365 4 dott glükózoxidázt tartalmazó reagens áramlik. Itt a mintavétel szekunder áramból történik, amely a meghatározandó glükózt tartalmazza, oly módon, hogy a glükóz féligáteresztő hártyán át a reagensáramba dializál. Ennek az eljárásnak az a hátránya, hogy a mérési eredmény elkészülése hosszú időt vesz igénybe, mivel a dialízis lassan megy végbe. Ismeretes továbbá olyan mérési eljárás is, amelynél az elektróda felületén közvetlenül rögzített glükózoxidáz van felhordva. A glükóz oxidációja az elektróda felületén megy végbe. Ez az eljárás azonban gyakorlatilag csak szakaszos glükózmeghatározáshoz használható, mivel az elektróda felületén csak korlátozott mennyiségű enzim rögzíthető, s így a glükóz átalakításához viszonylag hosszú időre van szükség. A találmány szerinti feladat olyan eljárás kidolgozása, amely az ismert eljárások fenti hátrányait kiküszöböli és amely főképpen nagyobb sorozatok vizsgálatának elvégzésére is mindenkor azonnal alkalmazható, gyors és hibamentes módszert biztosít. A találmány tárgya eljárás anyagok kvantitatív meghatározására oxigéntartalmú vizes oldatban, oxidáció vagy redukció útján, oxigénátvivő enzimek jelenlétében, az oxigénkoncentráció változását oxigént érzékelő elektróda segítségével mérve, oly módon, hogy a vizsgálandó anyagot tartalmazó oldat meghatározott mennyiségét légbuborékmentesen meghatározott oxigénkoncentrációjú pufferoldat konstans sebességgel folyó áramába, blokkszerűen, az áramlási sebesség változtatása nélkül adagoljuk, hordozóhoz kötött enzimen átvezetjük és az oxigént érzékelő elektródához vezetjük. A találmány szerinti eljárás olyan anyagok meghatározására alkalmas, amelyek oxigénátvivő enzimek jelenlétében oxigén felvétele vagy leadása közben átalakulnak. Ilyen anyagok például a cukrok, így a glükóz és gálaktóz,húgysav,nukleozidbázisok,ígya xantin és hipoxantin, citokróm, aminosavak, többszörösen telítetlen zsírsavak, hidrogénperoxid és egyéb szervetlen peroxidok. Oxigénátvivő enzimek, amelyek a találmány szerinti eljárás során hordozóhoz kötve alkalmazhatók, például a glükózoxidáz, galaktózoxidáz, urikáz, xantinoxidáz, citokrómoxidáz, aminosavoxidázok, lipoxigenáz, peroxidáz és kataláz. A találmány szerinti eljárásban az oxigénátvivő enzimeknek hordozóhoz kötött alakban kell jelen lenni. A hordozót illetően az a követelmény, hogy ahhoz az enzim nagy specifikus aktivitással kapcsolódjék és a hordozó bomlása és az enzimaktivitás csökkenése messzemenően ki legyen küszöbölve. Megfelelő hordozót ismertet például az 1 908 290 lsz. német közzétételi irat. A hordozót előnyösen szemcsés, oszlop töltésére al-Kalmas alakban alkalmazzuk, mely oszlopon a pufferoldat átáramlik. Eközben a pufferoldat-áramba blokkvagy dugószerűen (blockartig oder pfropfenartig) bejuttatott mintatérfogat a pufferoldattal bizonyos fokig keveredik. A hordozóhoz kötött enzimnek nagy specifikus aktivitással kell rendelkezni, mert ez a hordozóhoz kötött igen kis mennyiségű enzim használatát teszi lehetővé s ezáltal a mintablokk és a puíferoldat keveredése csökkenthető, a mintavétel gyakorisága növelhető, továbbá könnyen és gyorsan kiértékelhető mérési eredményeket kapunk. A hordozóhoz kötött enzim fajlagos aktivitása célszerűen legalább 10 E/g, előnyösen több mint 50 E/g és kiváltképpen előnyösen több mint 100 E/g legyen. A találmány szerinti eljárás lényeges jellemzője, hogy a meghatározandó anyagot (például glükózt) tartalmazó oldatot légbuborékmentesen, blokkszerűen vezetjük be a pufferoldat-áramba. Az oldatot a pufferoldat árammal 5 való lehető legkisebb keveredés mellett úgy juttatjuk be, hogy az mint egy folyadékdugó kerüljön az áramló folyadékba. Az oldatnak ily módon történő bevezetését például olyan tolattyú segítségével végezhetjük, amely megfelelő furatában tartalmazza az oldat mért mennyi-10 ségét, és a tolattyút úgy juttatjuk a pufferoldatáramba, hogy a mintaoldat blokk-, ill. dugószerűen kerüljön a pufferoldatba. A találmány szerinti eljárás további lényeges jellemzője, hogy a reakcióhoz hordozóként és reagensként 15 megfelelő pufferoldat konstans sebességgel folyó áramát használjuk. Konstans sebesség alatt azt értjük, hogy a sebesség annyira állandó, hogy az elkerülhetetlenül fellépő sebességingadozások oly csekélyek, hogy azokat az elektródával összekötött jelzőkészülék gyakorlatilag 20 nem regisztrálja. Ez a feltétel ideálisan teljesíthető, ha az oxigénkoncentráció konstans, amíg mintaoldat-blokk az elektródához nem jut. Ha ezt a konstans sebességet nem tartjuk be, akkor az állandóan jelző készülék színleg az oxigénkoncentráció változását mutatja. Ilyen változás 25 áll elő látszólag akkor is, ha a mintaoldat bevezetésénél a reagensáramba légbuborékok kerülnek. Lényeges továbbá, hogy a mintaoldat blokkszerű bevezetése a konstans sebességgel folyó pufferoldat áramlási sebességében változást ne idézzen elő, mivel ez is 30 meghamisíthatja a mérési eredményeket. Csak a találmány szerinti eljárás fenti, összes lényeges jellemzőinek az egyidejű jelenléte teszi lehetővé, hogy az eljárás alábbiakban ismertetendő előnyeit biztosítsuk, és hogy állandóan üzemeltethető, teljesen automatikusan műkö-35 dő berendezést alakítsunk ki, amely a kívánt méréseket elvégzi, anélkül, hogy bármilyen pipettázási művelet, térfogatmérés, időmérés, vagy hasonló mérések szükségessé válnának. A találmány szerinti eljárás kivitelezésére alkalmas, 40 oxigént érzékelő elektródák ismeretesek. Ilyenek például az L. Eschweiler und Co. oxigénelektródái, a Beckmann Instruments polarográfiás oxigénre érzékeny elektródája (39550) és a Hartmann und Braun AG, Frankfurt, oxigénelektródái. 45 A találmány szerinti eljárást előnyösen úgy végezzük, hogy a pufferoldatot az elektróda elhagyása után a körfolyamatba visszavezetjük, eközben az elhasználódott komponenseket pótoljuk. Ha például az eljárás során a meghatározandó anyag oxigénfelhasználás közben oxi-50 dálódik, akkor a pufferoldat oxigéntartalmát újra kiegészítjük. Ez történhet például oly módon, hogy levegőt vezetünk a pufferoldaton keresztül, célszerűen a pufferoldatot megfelelő ideig egy nagyobb tartályban tartva. Ha a meghatározandó anyag redukálódik az oldat 55 oxigéntartalmának növekedése mellett, akkor a felesleges oxigént eltávolítjuk úgy, hogy az oldaton megfelelő módon oxigénmentes vivőgázt, például nitrogént vagy nemesgázt vezetünk keresztül. Maga a pufferoldat a mindenkor alkalmazott enzim-60 nek megfelelő puffer vizes oldata a szokásos koncentrációban. A mindenkor használt enzimeknek megfelelő pufferok és pufferkoncentrációk, valamint a kedvező pH-értékek ismertek. A pufferoldat a pufferhatású vegyületeken kívül adott 65 esetben még más anyagokat is tartalmazhat, amelyek 2