166235. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5-metil-tetrahidrohomofolsav, 5,11-metilén-tetrahidrohomofolsav és 5,11-metenil-tetrahidrohomofolsav és alkáli fémsóik előállítására

-tetrahidrohomofolsavat (V képletű vegyület) elkülönítés nélkül egy alkálifémbórhidriddel, például nátriumbórhidriddel redukáljuk, amikor megkapjuk az 5-metil-tetrahidrohomofoJsavat (III képletű vegyületet) illetve ennek dinátriumsóját. Az eljárás egyes lépéseit gyorsan végezzük egymás után, szemben az irodalomban leírt, lépésenként külön-külön végzett eljárásokkal. A reakció elegyhez ezután ecetsavat adva és a pH-t 3,8 értékre állítva a kapott sók, mint a nátriumacetát és a bórsav alkohollal, például etanollal, könnyen elkülöníthetők. Alkoholban ezek a sók jól oldódnak, ezzel szemben a célvegyület az 5-metil-tetrahidrohomofolsav kvantitative kicsapódik. A reakció-oldatot egy éjszakán át egy hűtőszekrényben 3-10 °C-on tartjuk, majd a kicsapódó szennyezéseket szűréssel elkülönítjük. Az oldatban lévő terméket aktív szénnel kezeljük, az oldatot betöményftjük, majd az olajos maradékból abszolút etanol hozzáadásával a terméket lecsapjuk. A szárítás után kapott termék mennyisége 68%-os hozamnak felel meg. A bomlékony 5-metil-tetrahidrohomofolsav elkülönítésének ez a megoldása feleslegessé teszi az időigényes kromatográfiás elkülönítést és a végső hozam értékét ötszörösére növeli. Az 5- metil-tetrahidrohomofolsav előállítását és vizsgálatát részletesen az alábbiakban írjuk le. Az 5-metil -tetrahidrohomofolsavat Sakami, valamint Gupta és Huennekens folsav-származékok előállítására leírt eljárása szerint (1. a fentieket) állíthatjuk elő. A találmány szerinti eljárással tetrahidrohomofolsavat formaldehiddel kondenzálunk, majd a kapott 5,11-metilén-tetrahidrohomofolsavat egy alkáli bórhidriddel reduktív hasításnak vetjük alá. Ez a hasítás szelektíven megy végbe, és a metilénhíd 5-ös oldalán csekély vagy semmilyen hasadás sem megy végbe. A kiindulási anyagként alkalmazott tetrahidrohomofolsavat homofolsav katalitikus hidrogénezésével állíthatjuk elő. A hidrogénezést platinaoxid katalizátor jelenlétében csekély túlnyomással végezzük. A katalizátort a hidrogénezést követően szűréssel elkülönítjük, és a kapott vegyületet azonnal formaldehiddel kezeljük. Az elegyhez 55°C-on nátriumbórhidrid-oldatot adunk, majd a reakcióelegyet további 2 óra hosszat 55°C-on tartjuk. A kapott reakcióelegyet DEAE- cellulóz-oszlopon kromatografáljuk ammónium-166235 4 acetátoldat alkalmazásával. Az 5-metil-tetrahidrohomofolsavat abszolút etanol alkalmazásával fehér porként lecsapjuk. A hozam 46%-os. A terméket analízisnek, papír és vékonyréteg kromatográfiaiak, spektrumvizsgálatnak (1,7 és 13 pH-n) vetjük alá. 5 Az 5-metil -tetrahidrohomofolsav előállításában közbenső termékként jelentkező 5,11-metilén-tetranidrohomofolsavat (V képletű vegyület) az alábbiak szerint állítjuk elő. Homofolsavat katalitikus hidrogénezéssel tetrahidrohomofolsawá alakítunk. A 10 kapott termékhez azonnal formaldehidet adunk és az elegyet 55 °C-on 30 percig hőkezeljük. A reakcióelegyet DEAE cellulóz oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként 1% formaldehidet és 0,5% merkaptoetanolt tartalmazó trietilammóniumhidrogénkarbo-15 nát-oldatot alkalmazunk. A terméket etanollal fehér porként csapjuk le, majd vizsgálatnak vetjük alá. Nátriumbórhidrides redukciót alkalmazva szelektíven 5-metil-tetrahidrohomofolsavat kapunk. Az 5,11-metenil -tetrahidrohomofolsavat (IV 20 képletű vegyület) tetrahidrohomofolsav és hangyasav reakciójával állítjuk elő. A reakció-körülményektől függően többféle vegyület keletkezik, amelyeket DEAE-cellulózon kromatografálva választunk el, majd a kapott vegyületeket analízisnek vetjük alá. 25 A találmány szerinti eljárással előállított tetrahidrohomofolsav-származékok számottevő antileukémiás hatást fejtenek ki egereknél az L1210-FR8 tumor esetében. A homofolsav származékoknak antileukémiás hatá-30 sát írják le az alábbi közlemények: Mead J.: Ann, N.Y. Sei.: 186 514-515 (1971); Mead és tsai: Cancer Research: 2374-2379 (1966). A kedvező terápiás hatást fokozza az a körülmény, hogy a vegyületek oxidációval szemben jelentős stabi-35 htást mutatnak. A vegyület hatásossága feltehetően annak tulajdonítható, hogy a timidilátszintetáz funkcióját akadályozza. A vegyületek hatásosságát a leukémia terápiában általánosan alkalmazott methotrexate: 40 N- {p- { [(2,4-diamino -6-pteridil)-metilj-metilamino} -benzoil} -glutaminsav (amethopterin) hatásával hasonlítottuk össze. Az összehasonlító vizsgálatok eredménye szerint a találmány szerinti vegyületek kedvezőbbnek mutatkoztak a referencia vegyületek-45 nél. A vizsgálatok eredményét az alábbi táblázatok tüntetik fel. 1. táblázat 5-Metil-tetrahidrohomofolsav hatása a túlélési időre methotrexáte-ra szenzitív L1210 és L1210-FR8 leukémia esetében Kezeléshez használt Napi dózis* L1210 L1210-FR8 vegyület mg/kg túlélési Túlélési ÉlettarTúlélési Túlélési Élettaridő (naidő egyetam növeidő (naidő egyetam növepokban) di határkedés pokban) di határkedés értéke %-ban értéke %-ban Üres kontroll anyag 9 9-11 0 9 8-9' 0 Methotrexate 3 17 13-23 88 8 8 -12 1,5 21 13-23 133 8 8 -12 0,75 16 14-20 77 8,5 8-9 - 5 0,37 13 12-14 44 9 9-10 0 5-Metil-tetrahidro- 400 13, 12-14 44 . 17 14-23 88 homofolsav 200 14 13-15 55 17 14-23 88 100 11 9-12 22 15 12-19 66 Tetrahidrohomof oi- 400 10 6-14 11 13 11-19 44 -, sav 200 12 10-12 33 12 10-12 33 100 11 9-12 22 19 10-25 110 A kezelést a tumor-átültetést követő 3. napon kezdtük el; a kezelést az állatok elpusztulásáig folytattuk. Az egyes csoportokban 8-8 állat volt.