165957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav előállítására fermentációval

13 165957 14 5. példa A következő tanulmányokban fermentáló közegként komplex szerves közeget alkalmazunk. Az oltóközeget az 1. példában leírtak szerint készítjük. Az első oltóközegből 2,5%-os oltóanyagot adagolunk 2% Fleischman S-l 50 (Fleischmann Yeast Company, Stamford) élesztő autolizátumot tartalmazó, pH = 7 értékű második oltólombikba. A második oltó szakaszban - 48 órás inkubálási idő elteltével 1 ml-t használunk az egyes lombikok beoltására, az egyes lombikok 40 ml komplex szerves közeget tartalmaznak. A közeg összetétele a következő: Komplex szerves közeg: Eredeti szárított élesztő Desztillációs maradék Glidn L-fenilalanin Kukoricakeményítő Mobil Par-S habzásgátló (Mobil Oil Company, New York) Desztillált víz pH 7,5 értékre beállítva. Dextrin 10,0 g Élesztőkivonat 1,0 g Hidrolizált kazein (N-Z Amin, 2,0 g A-típus) Marhahúskivonat 1,0 g Agar 20,0 g Ionmentes víz 1,0 liter. E közeg pH értékét 7,0-re állítjuk be 10 nátriumhidroxid adagolásával. A ferde tenyészeteket ezután hét napon át 28 C° hőmérsékleten inkubáljuk, azután pedig hideg helyen tároljuk. 15 B-lépés: oltóközeg Az A-lépés ferde tenyészetét használjuk a következő összetételű oltóközeg lOOml-ének beoltására: 10 g 30 g 20 Glukóz 15,0 g 0,5 g Szójababliszt 15,0 g 3 g Kukoricalekvár, szilárd 5,0 g 20 g Kalciumkarbonát 2,0 g 2,5 ml Nátriumklorid 5,0 g 25 Ionmentes víz 1,0 liter 1000 ml A közegbe a jelzett mennyiségeket adagoljuk. A fermentálás teljes ideje 96 óra. A vizsgálatot az előbbiek szerint végezzük. Az eredmények a következők: 30 35 •§ y Adagolás 0 842A termelés figlml Adagolási idő, óra 0 24 48 72 E közeg pH-ját 6,7 értékre állítjuk be nátriumhidroxid hozzáadásával. Az oltó közeget ezután 28 C° hőmérsékleten 5 cm kitérésű, 220 ford./perc fordulatszámú „gyratory" rázógépen 48 óra hosszat inkubáljuk. C-lépés: Antibiotikum termelés Az oltó-szakaszból származó oltóanyagot (1,0 ml) használjuk 250 ml-es Erlenmeyer lombikokban levő egyenként 40 ml termelő közeg beoltására. E termelő közeg összetétele a következő: 1 2 3 4 5 6 kontroll 183 0,005% nátriumtioszulfát 0,01% nátriumtioszulfát 0,05% nátriumtioszulfát 0,10%nátriumtioszulfát 180 233 171 175 208 230 222 191 226 256 241 176 217 241 184 6. Példa Nátriumtioszulfát adagolása, módosított fermentálási eljárás. A-lépés: Ferde tenyészet 40 45 50 55 60 I. közeg: Keményítő Desztillációs maradék Szójabab-dara Glicerin Hidrolizált kazein (N-Z amin, A-típus) Vas(II)szulfát-heptahidrát Csapvíz 4,8% 0,5% 2,1% 0,8% 0,5% 0,01% 1,0 liter. Streptomyces clavuligerus tenyészet (NRRL 3585) liofilizált csövét aszeptikusán felnyitjuk és a mikroorganizmust a következő összetételű ferdeagar táptalajra visszük át: 6S Ezt az oldatot nátriumhidroxid hozzáadásával 6,5 pH értékre állítjuk be, 250 ml-es Erlenmeyerj lombikokba szétosztjuk és 15-20 percig 120C° hőmérsékleten, 15 psi nyomáson sterilizáljuk. Az inkubálást 4 napig végezzük, 28 C° hőmérsékleten, 220 ford./perc fordulatszámú, 5 cm-es kitérésű rázógépen. A fermentálás befejezte után a sejteket centrifugálással elkülönítjük és a fermentlevet foszfátpufferrel hígítjuk, pH érték 7,0. A fermentlében levő 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav koncentrációját a szabványos biológiai korongvizs-7