165764. lajstromszámú szabadalom • Eljárás profilaktikus készítmény előállítására szarvasmarha trychophytosis megbetegedés ellen

9 ' 165764 10 3. példa Iiofilizált készítmény előállítása A táptalaj előállítása: Előzetesen pasztőrizált, komló nélküli sörmalátát csápvízzel 7 súly% szénhidrát-tartalomra hígítunk, miközben a pH-értéket 6,8-7,0-ra álh'tjuk be. 2% agart adagolunk hozzá és melegítjük az agar feloldódásáig. Az oldatot 1,3-1,5 liter űrtartalmú tálcákban öntjük i0 300-300 ml mennyiségben, majd 0,5 at nyomáson 30 percen át sterilizáljuk. Sterilizálás után az így kapott maláta-agar pH-értéke 6,4-6,8. Az oltótenyészetet a 2. példában leírt módon végezzük. 10 000 dózis Iiofilizált készítmény elő- 15 állításához 20-22 tálcában tenyésztett mennyiségű TF130 kultúra szükséges. Az összes műveletet elszigetelt helyiségben, szigorú sterilitás mellett végezzük. A tenyészettel töltött tálcákat égő borszeszláng fölött nyitjuk ki, a biomasszát steril 2C Petri-csészékbe visszük. Négy tálcából nyert biomasszát 1,5 liter űrtartalmú kolloidmalomba teszünk, 500 ml 10súly% szacharózt és 2 súly% zselatint tartalmazó steril oldatot adunk hozzá, és 10 percen át homogenizáljuk. Fertőződés ki- 25 küszöbölésére a biomassza összegyűjtését és a kolloidmalomba való behelyezését égő borszeszláng felett végezzük. A homogenizált szuszpenziót lombikba öntjük. Koncentrációját az említett szacharóz-zselatin-ol- 30 attal 120-140 millió sejt/ml értékre állítjuk be. Antibiotikumot nem adagolunk hozzá. 10—10 ml szuszpenziót 200 ml űrtartalmú steril lombikba töltünk, a lombikokat négy réteg steril gézzel takarjuk be. Az így előkészített, a 35 szuszpenziót tartalmazó lombikokat 16—18 órán át —50 C°-on hűtőkamrában tároljuk, majd a szublimációs szárításra szolgáló készülékbe helyezzük. A szárítást 25 óra alatt 85—43 Hgmm nyomáson végezzük. A folyamat kezdetén a 40 termék hőmérséklete —40 és —50 C° között van, a szárítás során 18—20C°-ra emelkedik. A szárító készülék polcainak fűtését +20 C°-ra állítjuk be. A végtermék maradéknedvessége 1,8—2,0%. A Iiofilizált készítményekben levő sejtek ugyan- 45 olyan életképesek, mint a kiindulási szuszpenzió sejtjei. A készítmény felhasználása előtt mindegyik ampullába 200-200 ml steril fiziológiás oldatot töltünk. Az egyszeri dózis 5-10 ml. 50 A készítmény sterilitását, ártalmatlanságát és fajlagos aktivitását az 1. példában leírtak szerint vizsgáljuk. 55 4. példa 20 ezer dózis készítmény előállítása Táptalajként 6,4-6,8 pH-jú maláta-agart hasz- 60 nálunk. Oltóanyag előállítására a TF 130 törzset 1,5 liter űrtartalmú tálcában ferde maláta-agáron tenyésztett 12—15 napos tenyészetét 200 ml steril fiziológiás oldattal leöblítjük. A kapott szusz- 65 penzióval 30 db maláta-agart tartalmazó tálcát oltunk be, tálcánként 5—7 ml szuszpenziót alkalmazva. A tálcákat 12—15 napig 26C°-on termosztátban tartjuk. A növekedés a 4. vagy 5. napon válik láthatóvá. A tenyésztés 5. napján ' szúrópróbaszerűen vizsgáljuk a tenyészet tisztaságát. E célból Czapek féle agart és Kitt—Tarozzi féle táptalajt készítünk, tenyészetből vett mintával beoltjuk, majd a hús-pepton-főzetet, a hús-pepton-agart és a Kitt— Tarozzi féle táptalajt 37 C°-os, a maláta-agart és a Czapek féle agart 26 C°-os termosztátban 7 napig inkubáljuk. Ezeket a próbatenyészeteket mikroszkóppal vizsgáljuk meg esetleges mikroorganizmus szennyeződésekre. A tulajdonképpeni tenyészetet is vizsgáljuk vizuálisan és mikroszkóppal. Makroszkopikusan vizsgálva az egészséges tiszta 12 napos tenyészet a maláta-agar egész felületét borítja egyenletesen eloszlott, sima, fehér hártya alakjában. Mikroszkóppal a TF 130 morfológiai elemeit láthatjuk: a micéliumot, a micéliumon elrendeződött vagy fürt alakú halmozódásként elhelyezett 2—4 mikron nagyságú, ovális-hosszúkás mikrokonidiumok tömegét, valamint elkülönülten előforduló orsó alakú, 3—4 választófallal rendelkező makrokoni diumokat. A tenyészettel töltött tálcákat égő borszeszláng felett nyitjuk ki, a micéliumot a maláta-agar felületéről leszedjük és steril Petri-csészékbe visszük. 20 ezer egyszeri adag (mintegy 100 liter) készítmény előállításához 40—40 tálcában tenyésztett mennyiség szükséges. A Petri-csészékből a biomasszát 1,5 liter űrtartalmú steril kolloidmalomba töltjük, mégpedig egy menetre 4—5 tálca tartalmát 500 ml steril fiziológiás oldattal együtt. A szuszpenziót 20 percen át homogenizáljuk. A szuszpenzió kikészítésére 20 liter űrtartalmú üvegballonokat vagy 50 liter űrtartalmú rozsdamentes acéledényeket használunk. Nagyobb mennyiség előállítása esetén a sterilitásra vonatkozó szabályok szigorú betartása mellett nagyobb űrtartalmú edényeket is használhatunk. Az edényt kétrétegű géz-szűrőn keresztül a térfogatának háromnegyed részéig fiziológiás oldattal töltjük, majd háromrétegű géz-szűrőn- keresztül, időnként fiziológiás oldattal hígítva hozzáadjuk a szuszpenziót. Baktériumos szennyeződés elkerülésére penicillint és streptomicint adunk hozzá, 1 ml készítményre számítva 100—100 NE mennyiségben. A 20 literes ballonokba 5 tálcából származó, az 50 literes edényekbe 8-10 tálcából biomasszaszuszpenziót viszünk be. A szuszpenzió koncentrációját, a 2. példában leírtak szerint 6—8 millió sejt/ml értékre állítjuk be, a koncentráció megengedett tűrése ±20%. A készítményt ampullákba töltjük, és az ampullákat gépek segítségével vattacsomóval és fóliakupakkal elzárjuk. Idegen mikroflóra távollétét az 1. példában leírt módon töltött ampullák 2%-án vizsgáljuk. A készítmény ártalmatlanságát és aktivitását 3 házi nyúlon a megadott módon vizsgáljuk. 5