165752. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a B-5050 és a tetrahidro-B-5050 antibiotikum észtereinek előállítására
13 165752 14 II. példa Egyenként 500 ml sterilizált és az I. példában leírtakkal azonos összetételű tápoldatot tartalmazó 2 Uteres Sakaguchi-lombikba Streptomyces 5 hygroscopicus (IFO-12995) inokulumot adunk, és az inkubációt az I. példa szerinti módon végezzük. Egy 500 literes saválló acéltartályban a fermentációs tenyészethez 200 liter tápoldatot 10 készítünk elő, amelynek összetétele azonos az I. példa szerintivel. A tápoldatot 20 percig sterilizáljuk 121 C°-on, majd beoltjuk az előbbi bekezdés szerint előállított előfermentációs tenyészet 2 literével. A fermentlét 28 C°-on 15 inkubáljuk 24 órán át 200 liter/perc teljesítményű levegőztetés és 200/perc fordulatszámú keverés közben. Az így kapott fermentációs tenyészet 200 literét hozzáadjuk 4000 liter főtápoldathoz, amely- 2 c nek összetétele azonos az előbbi bekezdés szerintivel és amely egy 6000 literes saválló acéltartályba van betöltve. A fermentációt 28C°-on végezzük 48 órán át 2400 liter/perc teljesítményű levegőztetés és 180/perc fordulat- 2 5 számú keverés mellett. Az inkubáció közben habzásgátló szerként „Actocol"-t használunk az előbbiek szerint. A fermentlét leszűrjük. A 4000 liter térfogatú 30 szűrlet pH-ját 2n NaOH oldattal 9-re állítjuk be, azután a fermentlét 1330 liter etilacetáttal extraháljuk, az extraktumot vízzel mossuk és ekkor 1052 liter etilacetátos extraktumot kapunk. Ezt az oldatot vákuumban 100 literre tömé- 35 nyitjuk be. A betöményített oldatot 2 x 50 liter 1,5 m vizes KH2 P0 4 oldattal extraháljuk, amelynek pH-ját foszforsawal előzőleg 4,-re állítottuk be. Az extraktumokat egyesítjük, a pH-t híg vizes ammóniával 8,5-re állítjuk be és 50 liter 40 etilacetáttal extrahálunk. Az etilacetátos oldatot vízzel mossuk, megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A kapott szirupos maradékhoz 3 liter n-hexánt adunk. Ekkor 330 g nyers porszerű anyag válik ki, amelyet 1,1 liter benzolban 45 oldunk melegítés közben, majd az oldatot állás közben hűlni hagyjuk. Ekkor 117 g kristályos termék válik ki az oldatból, amely túlnyomórészt B-5050-C, -D, és -E antibiotikumokból áll. (I kristályos termék). 50 A foszfátos extrakció után visszamaradt etilacetátos fázist tovább extraháljuk 2 x 50 liter n/200 H2 S0 4 oldattal, a vizes fázisokat egyesítjük, a pH-t híg vizes ammóniával 8-íra állítjuk be, és 3 x 30 liter etilacetáttal extrahálunk. Az 55 etilacetátos extraktumokat egyesítjük, vízzel mossuk, megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. Az így kapott sziruphoz 1,5 liter n-hexánt adunk, mire 160g nyers porszerű anyag válik ki. A nyers porszerű anyag 150 g-ját forró benzolból 60 kristályosítjuk, és ekkor 72,5 g kristályos terméket kapunk, amely túlnyomórészt B—5050—A és -B antibiotikumot, amellett kis mennyiségű B-5050-C antibiotikumot tartalmaz. (II kristályos termék.) 65 Ezt a terméket az előbbiekhez hasonló módon vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk, és ekkor az (a) módszerrel felvett kromatogramon egy 0,48 és 0,54 Rf-értékű foltot, a (c) módszerrel felvett kromatogramon egy 0,66 és 0,71 Rf-értékű foltot kapunk. A II kristályos termék 2,0 g-ját 20 ml etilacetátban oldjuk, amelyhez azután 14 ml benzolt adunk. Az oldatot szilikagéllel töltött oszlopon (Merck A. G. NSZK cég által gyártott szilikagél, szemcsemérete 0,05—0,2 mm) kromatografáljuk, amelyet előzőleg azonos térfogatú benzol és etilacetát keverékével töltöttünk fel. A kromatogramot 1 :1 arányú etilacetát-benzol eleggyel fejlesztjük ki, majd 200 ml eluátum leszedése után 3 :2 arányú etilacetát-benzol eleggyel folytatjuk az eluciót, amikor is a Bacilus subtilis mikroorganizmussal szemben antimikrobiális aktivitást • mutató frakciókat kapunk. Az azonos hatóanyagokat tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk és benzolból kristályosítjuk. Ekkor 435 mg B—5050—A antibiotikumot tartalmazó kristályos terméket, ill. 185 mg B-5050-B antibiotikumot tartalmazó kristályos terméket kapunk. Az I kristályos termék 10 g-ját 50 ml etilacetátban oldjuk, majd 25 ml benzolt adunk az oldathoz. Az oldatot 400 g szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk az előbbiekhez hasonló módon. Az oszlopot előbb 3 liter 1 :1 arányú etilacetát-benzol eleggyel, majd 2 :1 arányú etilacetát-benzol eleggyel eluáljuk. Az eluátumot 500 ml-es frakciókban szedjük. Az 1:1 arányú eleggyel eluált frakciók B—5050—A és -B antibiotikumot tartalmaznak. A 2 :1 arányú eleggyel eluált első frakció B—5050—B és -C antibiotikumot, a második B—5050-C és -D antibiotikumot, a harmadik B—5050—D és -E antibiotikumot, az utolsó frakció pedig B-5050-E és -F antibiotikumot tartalmaz. A B—5050—B és -C antibiotikumot tartalmazó frakcióból nyert 2g kristályos anyagot 15 ml etilacetátban oldjuk, majd 10 ml benzolt adunk az oldathoz. Az oldatot 250 g szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 3:2 arányú etilacetát-benzol eleggyel eluáljuk és 20 ml-es frakciókat szedünk. Az azonos komponenseket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk és benzolból vagy etilacetát-n-hexán elegyből kristályosítjuk. Ekkor 83 mg B-5050-B antibiotikumot tartalmazó kristályos terméket, 940 mg B-5050-C antibiotikumot tartalmazó kristályos terméket és 75 mg B-5050-D antibiotikumot tartalmazó kristályos terméket kapunk. Hasonló módon a B—5050-D és -E antibiotikumot tartalmazó frakció 1,2 g-ját szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk, és ekkor 600 mg kristályos B—5050—E antibiotikumot kapunk. A B-5050—B és -C antibiotikumot tartalmazó frakció után szedett frakció fő komponensként B—5050—C antibiotikumot tartalmaz. A frakcióból kinyert 770 mg nyers kristályos anyagot újra feloldjuk 5 ml acetonban, és az oldatot 100 g szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk a fenti ismertetett módon, amikor is 220 mg kristályos B—5050—C antibiotikumot kapunk. 7
