165728. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid ipari méretű foszforilálására alkalmas NAD-kináz enzimkészítmény előállítására

SZABADALMI 165728 MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG LEÍRÁS SZOLGÁLATI TALÁLMÁNY ÄS^ Nemzetközi osztályozás: IHf Bejelentés napja: 1973. IV. 02. (RE-532) C 07 g 7/026 ^^ Közzététel napja: 1974. V. 28. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL Megjelent: 1976. VI. 30. Feltalálók: BODOKI Béka vegyész, 45%, EGERVÁRI Márta dr. Gráf Lászlóné vegyészmérnök, 20%, Dr. GÁNTI Tibor vegyészmérnök, 30%, Dr. PÁLMAI György vegyészmérnök, 5% Budapest Tulajdonos: REANAL Finomvegyszergyár, Budapest Eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid ipari méretű foszforilálására alkalmas NAD-kináz enzimkészítmény előállítására 1 A találmány eljárás olyan NAD-kináz készítmény előállítására, amely különösen alkalmas nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) ipari méretű foszforilálására nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP) nyerése céljából. 5 A NADP az élő sejtekben, szövetekben általánosan fellelhető vegyület, amely koenzim tulajdonságú és a redox enzimek által gyorsított reakciók nagy részénél specifikus hidrogénakceptorként viselkedik. A NADP így elvileg bármilyen 10 élő szövetből kinyerhető, azonban a természetes anyagokból történő előállítása iparilag gazdaságosan nem oldható meg, mivel a sejtek a NADP-t csak rendkívül kicsiny és változó koncentrációban tartalmazzák. Laboratóriumi preparálási eljárá- 15 sok ismeretesek, ezek közül a legjobb eredményt Tamagnone és De Maria eljárása adja (Int. Z. Viruschforsch. 38, 224—226 (1968), amelyik 23%-os hozammal 85% tisztaságú végterméket nyer. 20 Az iparilag is alkalmazható eljárások alapja Altman és Evans módszere (J. Biol. Chem. 169, 463—464 [1947]), akik galambmáj acetonpor vizes extraktumának dialízisével olyan enzimoldatot nyertek, amelyik képes volt adenozintrifoszfát je- 25 lenlétóben a NAD-ot foszforilálni NADP-vé. Ezt az elvet alkalmazták Wang és munkatársai (J. Biol. Chem. 211, 465 [1954]) a NADP preparatív előállítására oly módon, hogy a galambmáj acetonpor extraktumából részlegesen tisztított NAD- 30 kináz készítményt állítottak elő (Wang és Kaplan J. Biol. Chem. 206, 311 [1954]), majd NAD-ot és ATP-t tartalmazó oldathoz adva az enzimkészítmény max. 53%-os konverzióval NADP-t, NAD-ot, ADP-t és ATP-t tartalmazó reakcióelegyet nyertek, amelyből a NADP-t ioncserélős tisztítással nyerték ki 83—92%-os tisztaságban. Az eljárás ipari alkalmazását a galambmáj korlátozott beszerezhetősége akadályozza. Ezt a problémát oldja meg az 157 295 lsz. magyar szabadalom szerinti eljárás, amely szerint az NADP-t előállító reakció katalíziséhez olyan NAD-kináz enzimkészítményt használnak, amelyet a 157 298 lsz. magyar szabadalom szerinti eljárással csirkemájból készítenek. A NAD-kináz enzimkészítményt előállító utóbbi eljárás alapja az, hogy nyers csirkemájat vízzel vagy vizes sóoldattal extrahálva, és az extraktumot hőkezelésnek alávetve találhatók olyan hőmérséklet-idő intervallumok, amelyeken belül a NAD-kináz enzim még nem károsodik, de az extraktumban szintén jelenlevő és az ATP-t bontó ATP-áz inaktiválódik, ha a hőkezelést megelőzően az enzimet szelektív adszorpcióval és/vagy kisózással részlegesen előtisztítják. A hőkezelést követően a NAD-kinázt tartalmazó oldatból az enzimet a szokásos biokémiai módszerekkel nyerik ki. Az eljárás — bár az eddig ismertek közül a legjobb NAD-kináz előállítására — hátránya az a 165728 1