165725. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új enzimkészítmény előállítására
165725 13 14 a parenterális adagolás céljaira alkalmas vizes közegben oldjuk. Gyakorlati célokra a 2 cm3 menynyiségű vizes enzimkészítmény oldatot tartalmazó ampullák különösen alkalmasak. Az ilyen vizes enzimkészítmény oldat célszerűen kb. 0,9% nátriumkloridot, kb. 0,3—0,5% fenolt, és kb. 0,01—0,2% részlegesen hidrolizált zselatint tartalmaz (stabilizálószerként). pH-ja kb. 5,0—8,0, célszerűen 6,5. A találmány célkitűzése továbbá olyan vegyszer előállítása, amely előnyösen alkalmazható emlősök és különösen az emberi vér in vitro vizsgálatára, például a fibrinképződés vagy a fibrinképződósben fellépő rendellenességek vizsgálatára, a fibrinogen szint gyors meghatározására heparin jelenlétében, a fibrin és a fibrin bomlástermékek gyors kimutatására a plazmában és trombin helyettesítőszerként a véralvadás tesztekben. A vegyszert a találmány továbbfejlesztése szerint gyakorlati célokra alkalmas módon olyan készítményből állítjuk elő, amely például 10—50 mikrogramm fagyasztva-szárított enzimkészítményt, stabilizálószerként 1 mg részben hidrolizált zselatint, 2 mg metil-p-oxibenzoátot, 8,5 mg nátriumkloridot és 34 mg-ig glicint tartalmaz. Az ily módon kapott készítményt 1 cm3 desztillált vízben oldjuk. Ez az oldat vegyszerként közvetlenül felhasználható. A találmány szerinti eljárást és annak továbbfejlesztését az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példák szemléltetik. A példák szerinti különböző kígyómérgek a PENTAPHARM AG, Basel, Svájc, vagy MIAMI SERPENTARIUM, Miami 56, Florida, USA cégek révén szerezhetők be. 1. példa 20 g Bothrops atrox mérget feloldunk 1000 cm3 0,9%-os nátriumklorid oldatban, és az így kapott oldatot 10 percen át 3000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A csapadékot eldobjuk. A centrifugált oldat pH-ját híg ecetsavval 3,5-re állítjuk be, az oldatot vízfürdőn 1 órán át 30 °C-on melegítjük, majd ismét centrifugáljuk. A maradékot eldobjuk, míg a centrifugált oldatot NaOH-dal pH = 6,5-re állítjuk be, térfogatát pedig 0,9%-os. konyhasó oldattal 1000 cm3 -re egészítjük ki. Az így kapott oldathoz keverés közben 670 cm3 telített ammónium szulfátoldatot adunk. A keveréket szobahőmérsékleten 1 órán át állni hagyjuk, és a kivált csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A centrifugált oldathoz további 552 cm3 telített ammóniumszulfát oldatot adunk, és a keveréket 1 órai állás után újból centrifugáljuk. A centrifugált oldatot elöntjük, a csapadékot 100 cm3 desztillált vízben oldjuk, és az oldat pH-ját híg ecetsavval 5,0-ra állítjuk be. Az oldathoz most keverés közben 7,7 cm3 90%-os fenolt adunk, és a keveréket 15 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A csapadékként kivált enzimet centrifugálással elválasztjuk, és az oldatot elöntjük. A csapadékot két ízben 10—10 cm3 fenollal telített vízzel mossuk, centrifugán elválasztjuk és 50 cm3 mennyiségű, 1% ecetsavat tartalmazó etilalkohollal felvesszük. A keveréket 1 órán át keverjük, majd szívás alatt üvegszűrőn szűrjük. Az elválasztott szilárd anyagot 20 cm3 etilalkohollal több adagban mossuk és vákuumban szárítjuk. Ily módon 2—2,5 g I. tisztasági fokú enzimkészítmónyt kapunk, amelynek trombinszerű aktivitása 5 kb. 10—12 NIH-egység/mg szárazanyag. A termék tárolásakor állandó. A nyers enzimet 40 cm3 TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal vesszük fel (pH = 6,0, 0,02 mólos), ós az oldatot 15 percig keverjük. Az oldatlan részeket 10 centrifugálással eltávolítjuk az oldatból. A tiszta centrifugált oldatot 0,8—1,0 cm3 /perc sebességgel 200 cm3 , előzetesen TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal kiegyensúlyozott DEAE-Sephadex oszlopra öntjük, majd az oszlopot 800 cm3 mennyiségű 15 ugyanilyen kiegyenlítő oldattal eluáljuk. Az első eluátum frakciót elöntjük, majd az enzimet 400 cm3 TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal (0,04 mólos) eluáljuk. Az aktív eluátumot gyűjtjük, nyomás alatt UM—10 ultraszűrőn (Amicon) töményítjük 20 és sómentességig mossuk. A sómentes koncentrátumot vákuumban foszforpentoxidon szárítjuk vagy fagyasztva-szárítjuk. Ily módon 200—250 mg II. tisztasági fokú enzimkészítményt kapunk, amelynek aktivitása kb. 100—150 NIH-trombin-25 egység/mg fehérjetartalom. A sómentes sűrítményt az ultraszűrőn tovább töményítjük 5 cm3 térfogatig. Az oldatot az esetleges por eltávolítása érdekében G—4-es üvegszűrőn szívatjuk át, majd a tiszta oldatot hűtő-30 szekrényben +2 °C hőmérsékleten legalább 24 órán át állni hagyjuk. Az enzimkészítmény téglatest alakú kristályok alakjában válik ki. A kristályokat 0—2 °C hőmérsékleten végrehajtott centrifugálással elválasztjuk, több ízben 0,5 cm3 -es 35 desztillált víz adagokkal jéghűtés közben mossuk, végül foszforpentoxidon szárítjuk. Ily módon 45 mg mennyiségű színtelen enzimkészítményt kapunk, amelynek aktivitása kb. 150—200 NIH-trombin-egység/mg fehérjetartalom. 40 O 'U 2. példa 20 g Bothrops atrox mérget feloldunk 1000 cm3 0,9%-os nátriumklorid oldatban, és a kapott oldat pH-ját 6,5-re állítjuk be. Hozzáadunk 670 cm3 45 telített ammóniumszulfát oldatot és a keveréket 20 °C-on 1 órán át állni hagyjuk, majd centrifugáljuk. A centrifugált oldathoz további 552 cm3 telített ammóniumszulfát oldatot adunk, 1 órai állás után a keletkezett csapadékot centrifugálás-50 sal elválasztjuk és feloldjuk 100 cm3 desztillált vízben. Az oldat pH-ját híg ecetsavval 3,5-re állítjuk, majd az oldatot 1 órán át 30 °C-on melegítjük. A keletkezett csapadékot centrifugálással elválasztjuk, a centrifugált oldat pH-ját 5,0-ra ál-55 lítjuk be, 3 cm3 m-krezolt adunk hozzá, és szobahőmérsékleten 15 órán át állni hagyjuk. A kivált csapadékot centrifugálással elválasztjuk, kétszer 10 cm3 krezollal telített vízzel mossuk, és 50 cm 3 desztillált vízben, In NaOH oldat hozzáadása 60 közben, pH = 8,0-ln feloldjuk. A fel nem oldódott részeket centrifugálással eltávolítva, az oldatot AMICON UM—10 ultraszűrőn szűrjük, és a szűrés maradékát desztillált vízzel addig mossuk, amíg a távozó szűrletben ferrikloridos reakcióval 65 krezol többé nem mutatható ki. Az enzimtartalmú 7
