165705. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertés száj- és körömfájás vírus tenyésztésére és oltóanyag előállítására IB-RS-2 sejteken
165705 Tripszines kezeléssel nyert IB—RS — 2-sej tekét glicerin tápközegben vagy egy dimetilszulfoxidot is tartalmazó tápközegben 1—2X 106 sejt/ml mennyiségben szuszpendálunk. Zárt ampullákba történő szétosztás után ezeket a sejteket fokozatos hőmérsékletcsökkentést biztosító mélyhűtő berendezésben befagyasztjuk és ezután folyékony nitrogénben vagy mélyhűtőben —40 °C-on raktározzuk. A felhasználáshoz egy vagy több ampullát 37 °C-os vízfürdőn felengedünk. A sejteket a tenyésztő közegben 80 000/ml mennyiségben szuszpendáljuk. Az alkalmazott tenyésztő közeg 0,5% laktalbuminhidrolizátumot, 0,1% élesztő kivonatot, 0,1% glukózt, 5—10% sertéssavót (vagy marha- vagy lósavót) és 0,1% nátriumdikarbonátot tartalmazó Hanks (vagy Earle) oldat. A Hanks-féle lúgos sóoldat összetétele: mg/liter CaCl2 .2H 2 0 KCl KH2 P0 4 MgCl2 .6H 2 0 MgS04 .7H 2 0 NaCl NaHC03 Na2 HP0 4 .7H 2 0 Dextróz Fenolvörös 186,0 400,0 60,0 100,0 100,0 8000,0 350,0 90,0 1000,0 20,0 Az Earle-féle lúgos sóoldat összetétele: mg/liter CaCl2 .2H 2 0 KCl MgS04 .7H 2 0 NaCl NaHCOg NaH2 P0 4 .H 2 0 Dextróz Fenolvörös 265,0 400,0 200,0 6800,0 2200,0 140,0 1000,0 10,0 Az Earle-féle közeg leírása a következő közleményben található: Earle, H.: Science, 130, 432, 1959. Ehhez a tápközeghez pufferolt, kalcium- és magnéziumsókat nem tartalmazó konyhasóoldatban 0,25%-ra hígított tripszint, pl. Difco 1/300-t adunk. Ez utóbbi készítmény biológiai aktivitása 300 tripszin egyenérték, vagyis a készítmény 1 g-ja 300 g kazeint képes lebontani. A 80 000 sejt/ml tápközeg töménységű sejtszuszpenziót rögzített vagy forgó lombikba osztjuk el 0,4 ml/cm2 felület mennyiségben. A rendelkezésre álló felületre oltott sejtek mennyisége így kb. 30 000/cm2 lesz. Az ily módon beoltott felületeket 3—4 napon át inkubáljuk, és a lombikokat 5 percben egyszer megfordítjuk a zárt és vastag hártya kialakulása céljából. A sejtek száma így eléri az 500 000—600 000/cm2 felület mennyiséget. A sejttenyészet tápközegét eltávolítjuk és 300 tripszin egyenérték biológiai aktivitású tripszinkészítmóny pufferolt sóoldattal készült 2,5%-os oldatával pótoljuk. Az enzimatikus kezelést 8 órán át 37 °C-on végezzük. A tripszintartalmú közegben 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 szuszpendált sejteket savó tartalmú tápközeggel olyan mennyiségűre hígítjuk, hogy ismét ml-ként 80 000 élőképes sejtet tartalmazó sejtszuszpenziót kapjunk. így annyi altenyészetet kaphatunk, amennyi a sejttömeg üzemi méretben történő szaporításához elegendő. Az altenyészetek maximális száma itt 10. Ha a kapott sejtfelület elegendő, elkezdhetjük a vírus tenyésztését. A tápközeget eltávolítjuk és ugyanilyen, de savót nem, hanem az oltó vírust tartalmazó tápközeggel pótoljuk. A vírus szaporításához használt tenyésztőközeg mennyisége 0,1 ml/ cm2 hártyafelület. A vírusoltványt addig hígítjuk, míg a fertőző egységek koncentrációja 10~5 —10 -6 / ml lesz. A vírusok tenyésztését 12 órán át folytatjuk. Ez alatt az idő alatt az összes sejthártyát a vírus szétroncsolja, és a sejtek lízist szenvednek. A vírusszuszpenziót kb. +4°C-ra hűtjük. Ezt a vírusszuszpenziót centrifugáljuk és szűrjük a sejtmaradványok eltávolítása céljából, majd formaldehiddel, glicidaldehiddel vagy acetil-etiléniminnel inaktiváljuk. Az inaktiválódás megvizsgálása után a vírusszuszpenziót ásványi olajból és emulgeátorokból álló keverékben emulgeáljuk oltóanyag előállítása céljából. Az is lehetséges, hogy egy ehhez hasonló oltóanyagban több különböző típusú vírusszuszpenziót egyesítünk és így pl. egy 3 értékű oltóanyagot kapunk. Néhány példa háromértékű oltóanyagok összetételére: 1. készítmény Glicidaldehiddel inaktivált vírusok víz az olajban emulzióban 0 típusú vírus szuszpenziója 100 ml A típusú vírus szuszpenziója 100 ml C típusú vírus szuszpenziója 100 ml Glicidaldehid 0,015 g Vazelinolaj (Mayoline) 270 ml Anhidrohexitoleát (Arlacel A) 30 ml 2. készítmény Formaldehiddel inaktivált vírusok víz az olajban emulzióban 0 típusú vírus szuszpenziója 100 ml A típusú vírus szuszpenziója 100 ml C típusú vírus szuszpenziója 100 ml Formaldehid 0,06 g Vazelinolaj (Mayoline) 270 ml Anhidrohexitoleát (Arlacel A) 30 ml 3. készítmény Glicidaldehiddel inaktivált vírusok vegyes emulzióban 0 típusú vírus szuszpenziója 100 ml A típusú vírus szuszpenziója 100 ml C típusú vírus szuszpenziója 100 ml Glicidaldehid 0,016 g Vazelinolaj (Mayoline) 262,5 ml Anhidrohexatoleát (Arlacel A) 30 ml Poliglikoléter és zsíralkohol speciális keveréke (Emulgine) 7,5 g 4
