165705. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertés száj- és körömfájás vírus tenyésztésére és oltóanyag előállítására IB-RS-2 sejteken
3 165705 4 Az IB—RS—2-sejtek folyékony nitrogénben vagy mélyhűtőben —80 °C hőmérsékleten eltarthatok. A szokásos tenyésztő közegekben, mint élesztőkivonattal, kazein hidrolizátummal vagy laktalbuminnal gazdagított Hanks vagy Earle alapsóoldat félszintetikus tápközeg vagy 199. típusú szintetikus médium, a sejtek egy rétegben szaporodnak. Ezekhez a szokásos tápközegekhez 5—10% sertés- borjúvagy lósavót adunk. A tenyésztő folyadék mennyiségót 0,4 ml/cm2 egyrétegű felület értékre állítjuk be. A sejtszaporodási hányados a tenyészetek között a tenyésztő közegtől és a tenyésztési időtől függően 3 és 10 közötti érték. Ajánlatos az IB—RS—2-sejtvonal jó állandóságának biztosítása érdekében az altenyészetek számának határt szabni. Ennél az előállításnál az eredeti sejtanyagból származó egymásutáni tenyészetek száma ne lépje túl a tízet. Azt találtuk, hogy az IB—RS—2-sejtek szuszpenzióban tenyészthetők. Az IB—RS — 2-sej tekét szuszpendálva tenyésztés céljából hosszú ideig mozgó és szellőző tenyészet feltételei mellett tartottuk. Ily módon a sejtek képessé váltak szuszpenzióban is szaporodni. Ebből a populációból egy ,,clonage"-t vettünk az ehhez a tenyésztési eljáráshoz legjobban alkalmazkodott sejtek kiválogatása céljából. Megállapítottuk, hogy a szuszpenzióban történő szaporodáshoz alkalmazkodott sejtek megőrizték érzékenységüket a sertésszáj- és körömfájást okozó vírussal szemben, és a szuszpenzióban szaporodó sejtekből származó vírusszuszpenzió ugyanolyan minőségű, mint az egy sejtrétegben tenyésztett sejtekből származó. A szuszpenzióban történő tenyésztés minden, a sejttenyésztésre alkalmas és mozgató, valamint szellőztető berendezéssel ellátott készülékben elvégezhető. Alkalmasak különféle aminosavakon és vitaminokon, fehér jehidrolizátumokon és élesztőkivonatokon alapuló tápközegek, mint pl. a MEM-Spinner médium. Minden esetben valamilyen cukrot és egy pufferolt fiziológiás oldatot adunk a tenyészethez. A szuszpenzióban növesztett tenyészeteknél éppúgy, mint az egyrétegben növesztett tenyészeteknél, a klasszikus tenyésztő közegekhez 5—10% borjú- vagy sertés-savót adunk. Megállapítottuk továbbá, hogy az egyrétegben növesztett vagy a szuszpenzióban történő tenyésztéshez alkalmazkodott IB—RS—2-sejtek nem okoznak tumort a hörcsögöknél: A hörcsögöket a pofazacskónál ÍOXIO8, 2X10 6 , 1X10 6 , és 1X10 5 élő sejttel beoltjuk. Az ötödik naptól kezdve egy kis csomó fejlődik ki a 10x 10e sejtadag hatására és ez a tizedik naptól kezdve fokozatosan eltűnik. Ez a csomó egy hónap múlva nem észlelhető és két hónap múlva tökéletesen eltűnik. 2x 106 alatti koncentrációnál öt nap után nem keletkezik csomó. Másrészről közölték (S. S. Breese; Archiv für die gesamte Virusforschung 30, 401—404, 1970), hogy az IB—RS—2-sejtek a PK 15 sertés sejtvonalhoz hasonlóan olyan részecskéket tartalmaznak, melyek vírusokhoz hasonlítanak, és 90 mft közepes külső átmérővel, valamint egy 60 m/j, nagyságú központi maggal rendelkeznek. Ezek a részecskék hasonlítanak a BHK 21 sejtvonallal kapcsolatban leírt sejtekhez. A SAO PAÜLO-ban működő BIOLÓGIAI INTÉZET kutatói, akik az IB—RS—2-sejtvonalat elkülönítették, már leírták a sejtvonal különböző klónjainak érzékenységét a sertés száj- és körömfájást okozó vírussal szemben. (ARQ. INST. BIOL. SAO 5 PAULO, 31 (3), 63—78, 1964; 31 (4) 155—156, 1964; 37 (2) 103—127, 1970). Azt találtuk, hogy a sejtek alkalmasak a sertés száj- és körömfájást okozó vírus (következőkben MKS vírus) szaporítására és olyan vírusszuszpen-10 ziók előállítására, amelyekből inaktiválás után az MKS vírussal szemben aktív és sertéseknek igen jó immunitást biztosító oltóanyagot kapunk, amely erősebb immunitást kölcsönöz a sertéseknek, mint azok az oltóanyagok, amelyeket másfajta heterológ 15 sejteken, mint pl. BHK 21 sejteken növesztett vírusok szaporításával állítottak elő. Ezenkívül az IB— RS — 2-sej tvonal, éppúgy mint a sertésveséből származó más sej vonalak vagy elsődleges tenyészetek, a fertőző gyomor-bélhurutot elő-20 idéző vírus szaporításához is felhasználható gazdasejtként. Ez a felsorolás nem meríti ki az IB—RS — 2-sejtvonal sejtjein szaporítható vírusok fajtáit. Minthogy az IB—RS—2-sejtvonal sejtjei sertésből származnak, különösen alkalmasak a sertésbetegsé-25 geket okozó különféle vírusok szaporítására. A kapott szuszpenziók lehetővé teszik olyan oltóanyagok előállítását, melyek a sertést semmiféle, a heterológ sejtekkel történő kezeléssel járó túlérzékenységgel nem veszélyeztetik. 30 A sertés száj- és körömfájás elleni oltóanyagot IB—RS—2-sejteken szaporított vírusból a találmány szerinti eljárással a következőképpen állítjuk elő: —180 °C hőmérsékleten tartósított IB—RS—2-sejtekből egy készletet veszünk és egyrétegben te-35 nyésztjük helyhezkötött Röux-lombikban vagy forgó lombikban egy hagyományos tápközegben, pl. élesztőkivonatot vagy laktalbumin-hidrolizátumot tartalmazó Hanks-oldatban, melyhez 5—10% sertés-, borjú- vagy lószérumot adunk. 40 Az is lehetséges, hogy az IB—RS—2-sejtek első tenyészetét egy rétegben MEM-Spinner közegben állítjuk elő, és ezután egy szuszpenzióban tenyésztett kultúrát beoltunk vele. A MEM-Spinner közeg összetétele: Aminosav-komponensek mg/liter L-arginin.HCl 126,4 L-cisztin 24,0 L-glutamin* 292,0 L-hisztidm.HCl.H2 0 41,9 L-izoleucin 52,5 L-leucin 52,4 L-lizin.H01 73,1 L-metionin 14,9 L-fenilalanin 33,0 L-treonin 47,6 L-triptofán 10,2 L-tirozin 36,2 Ii-valin 46,8 * az L-glutamint külön kell hozzáadni közvetlenül a 65 felhasználás előtt. 2
