165689. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tesztololaktonképződés megakadályozására androsztánvázas 3,17-diketoszteroidok mikrobiológiai előállításakor
3 165689 4 caucasicum (MNG 90) vagy Fusarium solani (MNG 91) vagy Penicillium lilacinum (ATCC 10 114) vagy Aspergillus flavipes (ATCC 11 013) gombák által progeszteronból vagy androszt-4-én-3,17-dionból történő előállításakor, amely abban áll, hogy a mikrobiológiai átalakítást dimetilformamid jelenlétében végezzük. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a dimetilformamid egyben az átalakítandó szteroid oldására is szolgál, s nincs szükség a végtermékként kapott androsztánvázas dion megtisztítására a gátlószertől, pl. a /3-naftoltól. További előnyt jelent a dimetilformamid alkalmazásakor a nagyfokú szelektivitás, ami a tesztololaktonképződés gátlása mellett zavartalan láncbontást, illetve láncbontást és dehidrogénezést eredményez. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa Fusarium caucasicum (MNG 90) egyhetes, burgonyás ferde agáron nőtt tenyészetéből 10 ml steril vízzel szuszpenziót készítettünk, és ennek 1—1 miével oltottunk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100—100 ml alábbi összetételű táptalajt: glükóz 5,00% KH2 P0 4 0,05% MGSO, KN03 NH4 N0 3 0,25% 0,10% 1,00% 28 °C-os termosztátszobában indukálva két nap rázatás után a tenyészet 5—-5 ml-ével 100—100 ml ugyancsak 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 1,5% peptont, 0,3% kukoricalekvárt (szárazanyagtartalom) és 0,005% glükózt tartalmazó táptalajt oltottunk, melynek PH-ját sterilezés előtt 6,5-re állítottuk be. Ujabb egynapos rázatás után az l-es lombikhoz 50 mg progeszteront, a 2-es lombikhoz 50 mg progeszteront és 5 mg /S-naftolt, a 3-as lombikhoz 50 mg progeszteront és 3 ml dimetilformamidot adagoltunk (a progeszteront minden esetben 1—1 ml acetonban oldottuk). Ezután a lombikokból további 24, illetve 96 órás rázatás után mintát vettünk, s kvantitatív rétegkromatográfiával meghatároztuk a fermentlé progeszteron-, androszta-l,4-dién-3,17-dion-, illetve 1-dehidro-tetsztololakton-tartalmát. Az 1. táblázatban összefoglalt meghatározási eredményekből megállapítható a dimetilformamid alkalmazásának előnye. 1. táblázat . A fermentlé Lombik száma Átalakítás ideje órában progesz teron and- , , L-deroszta- , ., 1 A hidrodién- íe f" 0 17 toló-dion lakton tartalma /^g/ml-ben 1 24 90 35 370 1 96 80 5 380 2 24 335 165 0 2 96 90 200 200 3 24 50 445 0 3 96 20 445 0 10 IS 20 25 30 35 40 45 50 2. példa Az 1. példában leírt módon állítottunk elő 10 liter tenyészetet, melyhez összesen 5 g progeszteront adagoltunk 300 ml dimetilformamidban oldva. Az adagolást követő 60 órás rázatás után a lombikok tartalmát egyesítettük, leszűrtük, és a szűrt fermentlét Sx^e térfogat 1,2-diklóretánnal extraháltuk. Az egyesített extraktumot vákuumban szárazra pároltuk. A bepárlási maradékot éterrel kristályosítottuk. így 3,84 g androszta-l,4-dién-3,17-diont kaptunk; op. 139—142 °C; [X]A = + 115° (c = 1, kloroform); Amax 245 nm-nél: E« = 538. 3. példa Az 1. példában leírt módon, de Fusarium solani (MNG 91) tenyészetéből kéxzített szuszpenzióval előállított 100—100 ml tenyészet közül az egyikhez 3 ml dimetilformamidban oldott 50 mg progeszteront, míg a másik lombikhoz 3 ml dimetilformamidban oldott 50 mg androszt-4-én-3,17--diont adagoltunk. 96 órás rázatás után a fermentlevek kvantitatív rétegkromatográfiás vizsgálata mindkét lombik esetén 80% feletti elméleti androszta-l,4-dién-3,17-dion keletkezést mutatott, ugyanakkor 1-dehidro-tesztololakton-képződés nem volt kimutatható. 4. példa Aspergillus flavipes (ATCC 11 013), illetve Penicillium lilacinum (ATCC 10 114) vagy Penicillium chrysogenum (MNG 117), vagy Penicillium adametzi (MNG 118) egyhetes, burgonyás ferde agáron nőtt tenyészetéből 10—10 ml steril vízzel szuszpenziót készítettünk, és ennek 1—1 ml-ével oltottunk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100—100 ml alábbi összetételű táptalajt: 60 pepton 0,8% dextróz 1,8% malátakivonat 0,8% kukoricalekvár szárazanyag-tartalom 0,2% NaCl 0,2% A lombikokat 28 °C-os termosztátszobában rázatva inkubáltuk két napig, majd lombikonként 50—50 mg progeszteront adagoltunk a lombikok egyik felénél 1—1 ml acetonban, a másik felénél 3—3 ml dimetilformamidban oldva, és tovább rázattuk még négy napig. Az ezt követő rétegkromatográfiás analízis az acetonos lombikok esetén kevés androszt-4-én-3,17-dion mellett hagy mértékű szteroid bomlást és sok tesztololaktont mutatott ki, ugyanakkor a dimetilformamidot tartalmazó lombikokban csak androszt-4-én-3,17--dion volt kimutatható. Szabadalmi igénypontok Eljárás a tesztololaktonképződés megakadályozására androsztánvázas 3,17-diketoszteroidok szteroid-1-dehidrogénáz és/vagy metilketon-oldallánc 2
