165648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás O-hidroxi-benzoesav alapú homo polimerek és enzimek komplexeinek előállítására

17 165648 18 11. példa A 10. példában ismertetett kísérleteket megismételjük a fenti példában ismertetett módon előállított N-akriloil-5-amino-szalicilsav homopolimer-titán(IV)-komplexet használva. Természetesen a titán-komplex előállításához ez esetben N-ariloil-S-amino-szalicilsavat használunk a megfelelő 4-aminosav helyett. Az így előállított titán-komplex-szel kapott szilárd halmazállapotú enzim aktivitását az I. táblázatban adjuk meg. 1.táblázat Kezelés ideje (10 perc) Példaszám Aktivitás mérése Felülúszó fázis Szilárd anyag Száraz súly mg 6 520 nm mg Glükóz 0.007 0.031 0.110 5.9 7 520 nm mg glükóz 0.002 0.001 — 8 520 nm mg glükóz -0.002 0.064 0.180 5.1 9 520 nm mg glükóz -0.002 0.024 0.130 4.8 10 520 nm mg glükóz -0.002 0.089 0.210 5.5 11 520 nm mg glükóz -0.010 0,086 6.6 Glükózfelszabadulás kezdeti aránya (mg/perc) Enzimegység mg polimer 0.110 0.180 0.130 0.210 0.208 0.104 0.196 0.155 0.211 0.175 0,208 12. példa 50 mg poli-5-savat aliquotot két percen 4-4ml-rel mosunk: tartalmazó, hat 4-4 ml-es át az alábbi pufferekből 1) 0,1 mólos acetát - pH 3,0, 2) 0,1 mólos acetát - pH 4,0, 3) 0,1 mólos acetát - pH 5,0, 4) 0,1 mólos acetát - pH 6,0 5) 0,1 mólos acetát - pH 7,0 és 6)0,1 mólos foszfát - pH 8,0, 35 40 45 majd az aliquotokat centrifugáljuk, és a visszamaradt szilárd anyagokat a megfelelő pufferek 2-2ml-ével újra szuszpendáljuk. Ezután az egyes 50 pufferekben 500 jug laktát-dehidrogenáz (marhaszívből elkülönített, szállító cége a Koch-Light Laboratories, aktivitása 201 egység/mg), 500 jug glükamiláz (15 ml „Agídex" nevű készítményből, amelyet 5 liter desztillált vízzel szemben 22 órán 55 át dializálunk sa víz egyszeri cseréje mellett, amikor is megközelítőleg 20 mg/ml koncentrációban glükamilázt tartalmazó oldatot kapunk), 500 jug glükóz-oxidáz (a Boehringer cég terméke, 2. minőség, aktivitása 70 egység/mg) és 500 yg 60 a-kimotripszin (szállítója a Worthington Biochemical Co. CDI/OCC cég, aktivitása 47 egység/mg) keverékét szuszpendáljuk, majd a szilárd anyagot (poli-5-savat) tartalmazó szuszpenziót két percen át keverjük. Centrifugálás után a felülúszó 65 folyadékfázis aliquotjait (500/d-t a laktát-dehidrogenáz, 25/d-t a glükóz-oxidáz, 500 jul-t az a-kimotripszin és 1 ml-t a glükamiláz meghatározására) megvizsgáljuk a laktát-dehidrogenáz aktivitásának meghatározására az 1. példában ismertetett módon, a glükóz-oxidáz aktivitásának meghatározására a Werner és munkatársai [Z.Anal. Chem., 252, 224-228 (1970)] által ismertetett módon, az a-chymotripszin aktivitásának meghatározására a Bergmeyer (Methods in Enzymic Analysis című könyv 800. oldalán) által ismertetett módon, valamint a glükamiláz aktivitásának meghatározására a Bernfeld és munkatársai [Methods in Enzymology, 1, 149 (1955)] által ismertetett módon. A kapott eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg. Az eredményekből láthatók, hogy mind a négy enzim komplexet képez a poli-5-sawal, azonban a komplexképződés az egyes enzimek tekintetében eltérő mértékben pH-függő. Laktát-dehidrogenáz, glükamiláz, glükóz-oxidáz és a-chymotripszin poli(N-akriloil-5-amino-szilicilsav)val végzett komplexképzése után kapott felülúszó folyadékfázisok enzimaktivitása optikai sűrűségben kifejezve A glükamiláz enzimaktivitása és az optikai sűrűség közötti lineáris viszony bizonyítására az alábbi két kalibrációs mérés eredményeit ismertetjük. 9