165580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliriboinozinsav és poliribo- 2-tiocitidilsav származékok és e vegyületek fém és ammóniasóiból álló komplexeinek előállítására
7 165580 8 góljuk és így a komplex képződése csak a szervezetben, illetve a sejttenyészetben megy végbe. Az A + B komplex fizikai módszerekkel mint az ibolyántúli abszorpciós spektrum hiperkróm eltolódásával, az az optikai forgatóképesség diszperziós spektrumával, a Svedberg-állandóval, (Ullmann Enciklopédia: 2/1 kötet, 880 oldal, München-Berlin kiadás 1961) a + m -vel, a szacharóz fajsúly-grádiens-frakcionálási módszerrel vagy kromatográfiával, inkább azonban biológiai módszerekkel határozható meg. A biológiai módszerek közé tartozik a komplex azon képessége, hogy interferonok képződését indukálja. A következőkben sismertetett kísérleti körülmények mellett egyik polinukleotid egyedi molekulalánca sem mutatja ezt az aktivitást. Az interferon előállítása a legfontosabb lehetőség a találmány szerint alkalmazott kétkomponensű komplexek jellemzésére, mivel a fizikai módszerek érzékenysége a komplex jellemzésére gyakran nem elegendő. Mivel a komplex UV-spektruma a két komponens összegspektrumából adódó spektrumhoz képest hiperkróm eltolódást mutat (ez például úgy határozható meg, hogy az oldatok spektrumértékét grafikus módon összeadjuk, mimellett az oldatok mindenkor azonos komponens-koncentrációban vannak jelen, amely a komplex koncentrációjának azonban csak 50%-át teheti ki) és ily módon A + B komplex képződését a fennálló hiperkrómia (%-ban kifejezve) mérése alapján célszerűen több hullámhosszon lehet kimutatni. A találmány szerinti kétkomponensű komplex különösen jól jellemezhető biológiai hatásával. A biológiai hatást, legegyszerűbben úgy válthatjuk ki, hogy a komplex védőhatását vírusinfekció ellen egy sejttenyészetben mérjük. Például a komplexből egy sorozathígítást állítunk elő a sejttenyészet fenntartó közegében, ezt követően szekunder nyúlvese sejtből készült zárt sejtmassza fölé az előbbi különböző hígítású oldatokat rétegezünk és 18-24 óra hosszat 35-37 C° közötti hőmérsékleten inkubáljuk. Inkubálás után a folyadékot a sejttenyészet edényekből eltávolítjuk, a sejteket egy alkalmas vírussal, például herpes simplex vírussal fertőzzük, agárral felülrétegezzük és mindaddig inkubáljuk, míg a vírusfertőzés következményeképpen fellépő sejtroncsolódás a kezeletlen kontrollhoz képest a sejtmasszában körülirtán kiemelhető foltot, úgynevezett plakk-ot (Plaques) eredményez. A sejtek megszínezése után a kialakult plakkok számát meghatározzuk, és megállapítjuk azt a komplexkoncentrációt, amely a kezeletlen kontrollhoz képest a plakkok számát 50%-kal csökkenti. Az előbbivel analóg kísérleti elrendezés mellett különböző sejtfajták és különböző vírusfajták alkalmazásával kimutatható, hogy a komplex védőhatása nem korlátozódik sem égy meghatározott sejtfajtára, sem egy meghatározott vírusfajtára. Az A + B komplex által kiváltott interferonképződés indukciójának kimutatására olyan meghatározást végzünk, hogy zárt sejtmasszát, például nyúlvese- vagy egér embrionális sejteket fenntartó közeg oldatával felülrétegezünk, amelyek A + B komplexet tartalmaznak. A képződött interferont ismert módszerekkel a felső folyadékrétegből izolálhatjuk és interferon alakjában kimutathatjuk. 5 Az interferon okozta vírus szaporodásgátlás kimutatására például nyúlvese sejtből álló zárt sejtmasszát, nyúl-interferonnal együtt éjjelen át inkubálunk, ezt követően pedig vírussal fertőzzük. A további kísérleti folyamat megfelel az előbbiek-10 ben leírt plakk-szám csökkentésnek. Ezzel a módszerrel az interferon-tartalom mérhető. Különböző vírusfajták mint például herpes simplex, vaccinia vesicular stomatitis-virus alkalmazásával a nem specifikus vírusérzékenység kimutatható. A 15 fajspecifikusságot azáltal igazoljuk, hogy például egér embrionális sejteket nyúl-interferonnal kezelünk. Ebben a kísérletben a vírusszaporodást nem lehet gátolni. Kimutatható az is, hogy tripszines kezelés után az interferonnak már nincs védő-20 hatása. Az interferon hatás függőségét a sejtek ribonukleinsav és proteinszintézis intenzitásától például úgy igazolhatjuk, hogy olyan sejteket, amelyeknek szintézis-rendszerét Actinomycin segítségével blokkoltunk, interferonnal kezeltünk. Az 2s ilyen sejtekben például a vesicular stomatitis virus szaporodását nem sikerül gátolni. Az interferon felszabadulását gerinces állatoknál, illetve embernél A + B adagolásával például úgy mutathatjuk ki, hogy a komplexnek egy 30 fiziológiás oldószerben például Hanksch-féle pufferoldatban készült oldatát intravénásán nyúlnak vagy egérnek injekció útján beadjuk, majd a kísérleti állattól például 2-6 óra eltelte után vért veszünk és a vérszérumban a fenti módszerekkel 35 az interferon mennyiségét mérjük és jellemezzük. A + B komplex vírusok elleni védőhatásának kimutatása közvetlenül állatkísérletekben is meghatározható, ha például egereket A+B komplex fiziológiás oldószerben készült oldatával intra-40 peritoneális módon kezelünk, majd az állatokat 1 nappal később, például herpes simplex vírussal fertőzzük. A dózistól függően a kezelés a túlélési idő meghosszabbodásához, vagy a fertőzés teljes átvészeléséhez vezet, míg a kezeletlen kontroll-45 egerek a fertőzés következtében elpusztulnak. Hasonló módon kimutatható a komplex védőhatása számos vírus, mint a vaccinia vírus, vesicular stomatitis vírus vagy az influenza vírus ellen. 50 Analóg módon meghatározható más fertőzésekkel szembeni védőhatás például élesztőn, mint cryptococcus neoformanson keresztül baktériumok, mint pneumococcusok vagy protozoák, mint plasmodin berghei, vagy eperythrozoon coccoides 55 ellen. A + B komplex különleges tulajdonsága az, hogy a specifikus védekezőfolyamatokat fokozza. Ha például tengeri malacot influenza vírus oltóanyaggal beoltunk és a kísérleti állatok felét 60 ezenkívül még A + B-vel kezeljük, akkor a kezelt állatok vérszérumában az antitestek hamarabb kimutathatók és magasabb titert érnek el. Az antitesteket ismeretes módon haemagglutinatios gátlási reakció vagy komplement-kötési reakció 65 útján mérjük. 4
