165478. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyagcseretermékek előállítására növényi sejtekből fermentációval

165478 15 nium steril levélmetszetet oltunk be. 8 nap alatt hegsejtek képződnek, ezeket azonos táptalajba visszük át, és további 10 napig inkubáljuk, amikor sejtek és kis sejtcsomók differenciálatlan diszperz szuszpenzió ját kapjuk. Ezt a sejtanyagot auxinmentes G táptalajjal mossuk és auxinmentes G táptalajt tartalmazó rázóedényekbe oltjuk át, 16 napig tartó 25 °C-os inkubálás után a mikroszkóppal végzett vizsgálat nagyszámú, teljes növénykezdeményt mutat, azaz az embriószerű részecskék szerkezete megfelel a normális növényi embriófejlődés szív- és torpedófázisának. 10 15 14. példa Differenciálatlan Rauwolfia serpentina sejttenyészet készítése Rauwolfia serpentina friss gyümölcsét gondosan meghámozzuk, a kemény héjat óvatosan feltörjük, és a belső érintetlen magot kiemeljük. A magok felületét 5 perces 1%-os nátrium-hipokloritos kezeléssel sterilezzük, majd steril vízzel mossuk. A steril magokat nedves steril szűrőpapíron Petrí-csészébe, 28 °C-on, inkubátorban csíráztatjuk. A csírázás 8 napon belül megindul, 18 nap elteltével a magoncok teljesen kinyúlnak • a maghéjból. Az érintetlen steril magoncokat Petri-csészében levő 10% steril kókusztejet tartalmazó MMS agárral készült táptalaj felszínére ültetjük át, 2 hét után hegsejtek jelennek meg a magoncok gyökerén, szárán, ezeket lemetszszük, és azonos összetételű friss táptalajba helyezzük. 2 hetes időközökben további 2 átültetést végzünk, majd .a sejtek válogatott részét 50 ml kókusztejjel készült folyékony MMS táptalajt tartalmazó, 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba viszszük. Több edényben differenciálatlan diszperz sejttenyészet jelenik meg, ezt az anyagot 2 hetenként G táptalajra átültetve tartjuk fenn. 15, példa Differenciálódó Rauwolfia serpentina sejttenyészet készítése Előző példa szerint előállított két, Rauwolfia serpentina diszperz tenyészetet tartalmazó edény tartalmát egyesítjük, a sejtanyagot háromszor 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav-mentes G táptalajjal mossuk és dekantáljuk. Az auxinmentesre mosott sejtanyagot auxinmentes, következő adalékot tartalmazó G táptalajba oltjuk le: Edény száma Auxinhatású anyag 1 nincs adalék 2 0,1 mg/l 1-naftalin-ecetsav 3 1,0 mg/l 1-naftalin-ecetsav 4 5,0 mg/l 1-naftalin-ecetsav 5 1,0 mg/l 3-mdol-ecetsav 6 5,0 mg/l 3-indol-ecetsav 20 25 35 40 45 50 55 60 9 10 11 16 10,0 mg/l 3-indol^ecetsav 20,0 mg/l 3-indol-ecetsav 0,5 mg/l 2,4-diklór-feinoxi-ecetsav 1,0 mg/l 2,4-diklór-fenoxi-eoetsav 5,0 mg/l 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav 8 napig tartó rotáló rázógépen történő inkubálás után az első 9 edényben (1—9 számmal) különböző mértékű differenciálódás figyelhető meg (a gyökérkezdemény megjelenésének bizonyítékaként) ; kismértékű az 5., 9. számú edényekben, jelentősebb az 1., 8. számú edényekben. Ezek az eredmények az alkalmazott három anyag relatív auxinhatás-erősségével függnek össze, vagyis a 2,4-diklór-fenoxi-eeetsav sokkal hatásosabb, mint az 1-naftalin-ecetsav, és ez sokkal hatásosabb, mint a 3-indol-ecetsav. így az 1 mg/l 2,4--diklór-fenoxi-ecetsav-tartalmú G táptalajból a Rauwolfia serpentina-isejtekét a 20 mg/l 3-indol-ecetsav-tartalmú G táptalajba víve, csökken az auxinhatás és bekövetkezik a kívánt differenciálódás. 16. példa Rezerpinkimutatás differenciálódó Rauwolfia 30 serpentina sejttenyészetben Az előző példában nyert 8. edény tartalmát dekantáljuk, és a gyökérkezdeményt tartalmazó szilárd anyagot 40°C~on vákuumban 6 óra hoszszat szárítjuk. A száraz anyagot mozsárban porrá törjük, 5 ml tömény ammónium-hidroxiddal megnedvesítjük és 30 ml benzollal eldörzsöljük. A benzolfázist centrifuga segítségével elválasztjuk, majd 40 °C-on nitrogénáramban szárazra pároljuk. A maradékot 2 ml 1 n sósavban szusz^ pendáljuk, és ezt 2 ml kloroformmal kivonjuk (a rezerpin sósavas sója kloroformban oldódik). A kloroformos kivonatot szárazra pároljuk, a maradékot 0,1 ml kloroformban felvesszük, és 5 X 20 cm-es szilikagél vékonyréget-kromatográfiás lemezre cseppentjük; n-butanol-ecetsav-víz 16:1:4 arányú elegyével kifejlesztjük, majd a kroimatogramot ui.. lámpával 360 nm-en. előhívjuk; ekkor 7 fluoreszkáló sávot láthatunk, ebből egy (Rf: 0,61) megegyezik egy másik lemezre felvitt összehasonlító rezerpin foltjával. A 0,ölnél kapott fluoreszkáló sáv nem tiszta rezerpin, mivel a fluoreszkáló szín kékebb, mint a tiszta rezerpin színe. Ezért ezt a sávot levesszük a lemezről, 2 ml metanolban áztatjuk, majd a metanolt nagy felbontású tömegspektrográffal vizsgáljuk. A tömegspektrográffal kapott spektrum 600—650-es tartományban mutat egy csúcscsoportot, ami jó 'egyezést mutat a tiszta rezerpinnél észlelt csoporttal. A fő csúcsot elemezve 608,2724 tömegegységet kapunk, ami jó egyezésben van a rezerpinnél mért 608,2733-as tömegegységgel. Ilyen módon igazolható, hogy a differenciálódó Rauwolfia serpentina szuszpenzióte-65 nyészet rezerpint termel.