165387. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(karbociklusos gyűrűvel kondenzált imidazolil)-rifamicin SV-származékok előállítására

Emberi vér lymphoblasíok Leukaemias lymphoblastokat izoláltunk leukophoresis által előidézett acut lymphocytás leukaemiában (ALL) szenvedő páciens perifériás véréből. A sejteket mostuk és az erythrocytákat eltávolítottuk hypotonias lízissel. Normál iymphocytákat egészséges donor perifériás véréből vettünk, miután a granulocytákat poliamid-gél-oszlopon végzett kromatografálásával eltávolítottuk. Ezeket phytohaemagglutininnel (PHA) stimuláltuk 72 órán át [Gallo és társai: Nature, 228, 927 (1970); Gallo és társai: Science, 165, 400 (1968)], hogy a DNS-polimeráz-aktivitást a maximumra növeljük. Ezeknek a sejteknek elegendő nagy mennyiségben való előállítása azonban problémát jelent, ezért a kezdeti tájékozódó vizsgálatok céljaira alkalmas kevésbé tisztított DNS-polimerázok előállításához emberi „normál" szövet-sejttenyészeteket (1788) használtunk. Ezeket a szövet-sejttenyészeteket az Associated Biomedic Systems, Inc.-től szereztük be. Az érdekesnek látszó vegyületeket azután normál és leukaemias vér lymphocytáiból előállított, erősebben tisztított enzimekkel részletesebben tovább vizsgáltuk. Ezeket a szövettenyészet-sejteket az Associated Biomedic Systems, Inc. bocsátotta rendelkezésünkre. DNS-polimeráz készítmények Sejt DNS-polimerázokat extraháltunk és tisztítottunk normál vér (PHA-val stimulált) lymphocytáiból. leukaemias vér lymphocytáiból és (1788) limphoid sejtekből, hypotonias puíféroldatbán végzett homogenizálással. Ezt követően az extralysosomális részecskéket Triton X 100-zal és/vagy erős sós extrahálással eltávolítottuk. Drfferenciálcentrifugálás után a sejtextraktumokat DEAE-cellulözon, foszfocellulózon és Sephadex G 200-on végzett oszlopkromatográfiával tovább tisztítottunk. DNS-polimeráz vizsgálata A DNS-polimeráz vizsgálatát 100 ,u\ végső térfogatban végeztük. A vizsgálandó keverék 50 mmól trisz-HCl puffert (pH = 8,3), 6.0 mmól magnéziumacetátot, 8,0 mmól ditiotreitet és 6,0 mmól nátriumkloridot tartalmazott. A pH beállítását az előzetesen dimetilszulf oxidban feloldott inhibitoT-vegyületek hozzáadása után végeztük. A dimetilszulfoxid végső koncentrációja 0,5% volt és a kontrollminták is ilyen mennyiségű dimetilszulf oxidot tartalmaztak. A vizsgálathoz olyan enzimkoncentrációt használtunk, ami mintegy 1,0 pmól/óra beépülést katalizál. Az enzimet a legtöbb esetben az inhibitor-vegyülettel 5 percig előinkubáltuk. A reakciót úgy indítottuk be, hogy templátként szintetikus DNS-at [poli d(AT), Miles Lab.] és DNS. RNS hibridet (oligo dT. poli rA) 5 ,"g/ml koncentrációban, vagy természetes temlátokat: aktivált 8 lazacsperma DNS-t 50 /íg/ml koncentrációban és endogén 70S virális RNS-at alkalmaztunk; továbbá 10 «Ci (3

H-metil)-TTP-ot (New England Nuclear, 18,6 mCi/,"mól, liofilizälva és újra old-5 va 0,01 mólos sósavban közvetlenül a felhasználás előtt) és dATP-ot (8X10~5

mól, szintetikus templáttal), vagy mind a három dezoxinukleozidtrifoszfátot 8X10-5

' mól, RNS- vágy DNS- irányított reakciók). Némely kísérletben 10 az enzimet és az inhibitor-vegyületet nem inkubáltuk előre. Ezekben az esetekben a reakciót úgy indítottuk be, hogy az enzimet hozzáadtuk az inhibitor-vegyül etet tartalmazó teljes reakciókeverékhez. Az inkubáció megkezdésékor és 30 15 perc inkubálás után mintákat vettünk, ezekben a folyamatot 2 ml 0,08 mólos nátriumpirofoszfáttal fejeztük be és 12,5%-os hideg triklórecetsavban élesztő-RNS-val (400 /tg) hordozón kicsaptuk. A termékeket Millipore-szűrőre gyűj-20 töttük, 5%-os triklórecetsavval és 1 ml dimetilszulfoxid-etanol-0,1 mólos nátriumklorid (0,5:70: :29,5) keverékkel alaposan átmostuk, szárítottuk és Packard-féle folyadékszcintillációs számlálókészülékben 2 ml BBS3-ban (Beckman) és 10 ml 25 liquifluorban (New England Nuclear) megszámláltuk. Azt találtuk, hogy 5—20 ,«g/ml koncentrációk szintetikus DNS-templáttal a leukaemias polimerázt 50%-<ban gátolják. A szintetikus RNS-templáttal (poli rA . rU) irányított reakcic 30 még érzékenyebb volt. Reprezentatív kísérletek, amelyeket természetes templáttal végeztünk normál- vagy tumor-sejt-polimerázon, azt mutatták, hogy a tumorenzimek a vizsgált vegyületekre ilyenkor még 35 érzékenyebbek. Az új rifamicin-származékok más biológiai tulajdonságai: egér, patkány és ember sejtjeinél a Moloney- és Kirsten-féle egér-sarcoma-vírustörzs által előidézett fókuszképződést gátolják: 40 a már transzformált egér- és embersejtek vírustermelését szelektíven gátolják; a visszafejlődő sejtek kimutatása, egér-sarcoma-vírus által transzformált nem termelő egér és patkány sejtrendszereket használva. A találmány szerinti ve-45 gyületek ezenkívül szelektív toxicitást mutattak /írusok által transzformált egér-, patkány- és embersejteken, ha azokat kolóniaképző képességükre vizsgáltuk. A vegyületek gátló hatását a Moloney sarco-50 mavírusok által előidézett fókuszképződésre BALB/3T3 szövettenyészeten a következő módszerrel vizsgáltuk: BÄLB/3T3 sejtkultúrát tenyésztettünk 250 mles műanyag palackokban. A táptalaj az ,,Eagle-55 féle minimális lényeges táptalaj" és 10% foetalis marhaszérum volt. A sejteket tripszin-EDTA-val szuszpendáltuk, a táptalajjal hígítottuk és ezután a sejtszámlálást Coulter-számlálókészülékkel végeztük. Tumor-homogenizátumként Molo-60 ney-féle egér-sarcoma-vírust használtunk. Négy passzázst végeztünk svájci származású, nagj; passzázsszámú egérembrió sejttenyészetében és a fókuszképző egységeket BALB/3T3 sejtekben vizsgáltuk. A vizsgálatok elvégzéséhez a Hartley 65 és Rowe: Proc. Nat. Acad. Sei., 55, 780 (1966) ál-