165202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növénylebontó enzim előállítására

165202 9 4,0% szacharóz 1,0% szójaliszt 0,5% ammóniumszulfát 1,0% kalciumkarbonát 1,0% kukoricalekvár ad 1000 ml víz, pH = 7,0 A táptalajt 1 órán át 121 °C-on, 1 atü nyomáson sterilizáljuk, a cukrot pedig külön sterilizáljuk, és lehűlés után steril állapotban juttatjuk a fermentorba. Az elegy pH-értékét sterilizálás után szükség esetén steril 2 n nátriumhidroxid-oldattal 6,7—7,0-ra állítjuk be. A fenti fermentlevet 500 ml, az 1. példában ismertetett módon előállított előtenyészettel oltjuk be. A fermentációt a főszakaszban 50—70 órán át 28 °C-on végezzük. Az elegyet 200 fordulat/perc sebességgel keverjük, és 0,85 liter levegő/percliter tápoldat sebességgel levegőztetjük A fermentáció menetét időnkénti mintavétellel követjük. 48 óra alatt az elegy PATE-aktivitása átlagosan 30 000 egység/ml értéket ér el. A fermentlevet centrifugáljuk, és 1 : 1,6 arányban acetonnal elegyítjük. A kivált terméket mossuk és szárítjuk. Világos színű, száraz port kapunk, amelynek aktivitása kb. 3000 egység/mg. 4. példa Az enzim folyamatos előállítása céljából egyszerű homogén nyílt rendszer elvén működő berendezést alkalmazunk. A fermentorhoz a •szubsztrátum bevezetésére, a fermentlé eltávolítására, a levegő be- és kivezetésére, továbbá a lúg és a sav adagolására szolgáló vezetékek csatlakoznak. A fermentor egy pH-elektród és egy hőmérséklet-érzékelő berendezés elhelyezésére alkalmas, valamint a mintavételt és az oltást lehetővé tevő csonkokkal van ellátva. A keverési sebesség 240 fordulat/perc. A hőmérséklet 28 °C, a munkatérfogat 1,5 liter. A fermentlevet 0,5 liter levegő/percliter fermentlé sebességgel levegőztetjük. A leszivattyúzott fermentlevet hűtött 500 ml-es szívópalackokban fogjuk fel. A fermentort és egy 10 liter befogadóképességű tartalék edényt a következő összetételű táptalajjal töltjük fel: 3,0%) oldható keményítő 1,0% hús-pepton 1,0% kalciumkarbonát 0,5% szójaliszt 0,5% kukoricalekvár 0,5% ammóniumszulfát 0,001% D 3600 polipropilénglikol ad 1000 víz pH = 7,4 Mindkét edény tartalmát 1 órán át 120 °C-on, 1 atü nyomáson sterilizáljuk. Ezután a fermentort gumicső segítségével összekötjük a tartalék edénnyel és a felfogóedényekkel. Lehűtés után, 28 °C állandó hőmérséklet elérésekor a táptalajt 150 ml, az 1. példában leírt 10 10 45 50 55 60 65 módon előállított előtenyészettel oltjuk be. 24 órás tenyésztés után a szivattyút működésbe helyezzük, és a tenyészetet állandó egyensúlyi áramlásban tartjuk. Az áramlási arányt úgy állítjuk be, hogy az edény tartalma 36 óránként egyszer teljes mértékben kicserélődjön (D = = 0,0296). A fermentorból 24 óránként mintát veszünk, és meghatározzuk a minták PATE-aktivitását. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük. 15 20 25 30 35 40 Ora 3. táblázat Aktivitás, egység/ml pH 20 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 2800 3900 9000 17000 16200 18000 18000 17400 16700 17900 16300 6,8 6,4 6,65 6,5 6,5 6,65 6,7 6,6 6,5 6,55 6,3 240 órás tenyésztés után a műveletet befejezzük, és az összegyűjtött fermentlevet feldolgozzuk. A fermentlé átlagos enzimaktivitása 15000 egység/ml. Nyers készítmény előállítása Az enzimkészítmény technikai elkülönítését ismert módon végezzük. A legcélszerűbb módszernek a szerves oldószerekkel, pl. metanollal, etanollal, izopropanollal, acetonnal stb. végzett kicsapás bizonyult. Az aktivitásban kifejezett hozam 65% és 90% közötti érték. 1 liter fermentiere számítva 5—15 g világos, nemhigroszkópos, vízben oldható port kapunk. Példa 30 liter 28000 egység/ml PATE-aktivitású fermentléből centrifugálással elkülönítjük az oldhatatlan anyagok fő tömegét. Steril szűrés után 26,2 liter szűrletet kapunk, amelynek pH-értékét 6,5-re állítjuk, és a szűrletet 5 °C-ra hűtjük. 50 liter 22 °C-os aceton hozzáadására csapadék válik ki. A csapadékot elkülönítjük, acetonnal kétszer mossuk és szobahőmérsékleten szárítjuk. 308 g 2100 egység/mg PATE-aktivitású port kapunk, hozam: 77%.