164997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(D-alfa-amino-alfa -fenil-acetilamino)-3-metil-CEF-3-ÉM-4-karbonsav enzimes előállítására
11 164997 12 10. példa A 8. példa szerint előállított 4 g szárított Achromobacter B-402-2 FERM-P 1095 sejtek 500 ml 6,0 pH-jú 0,1 mólos acet,átpuffer-oldattal készült 5 szuszpenziójához 50 mg lizozimet adunk, és 60 óra hosszat inkubáljuk, majd 2 mg dezoxiribonukleázt adunk hozzá, és további 10 percig inkubáljuk A reakciókeveréket centrifugáljuk, és 200 ml felülúszó folyadékhoz 10 g hidroxiapatitot adva, 1 10 óra hosszat állni hagyjuk. A szilárd enzimkészítményt oszlopra töltjük, és az enzimreakciót úgy hajtjuk végre, mint a 8. példában. így 90% cefalexin keletkezését észleljük. 15 //. példa 1% polipeptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó 7,0 pH-jú 1,3 liter vizes táptalajt 120 C°-on 20 percig sterilizálunk, majd 100 ml-es 20 adagokban 500 ml-es lombikokba töltjük. Mindegyik táptalajt beoltjuk Bacillus megaterium NRRL B-5385 törzzsel, és 30 C°-on 48 óra hosszat inkubáljuk. A baktériumsejteket a tenyésztés után eltávolítjuk, és 1 liter szüredék pH-ját 6-ra állítjuk be, majd 10 25 g Celite kovaföldet adunk hozzá, és 30 percig keverjük. Ezt az enzimkészítményt 1 cm átmérőjű oszlopra töltjük, 7,0 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferoldattal mossuk, majd 5 óra alatt 0,1% 7-ADCA-t és 1% 3( D-fenilglicin-metilészter-hidrokloridot tartalmazó 100 ml 7,0 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferoldatot vezetünk át rajta. A kapott 100 ml eluatumban a cetaiexinképződést 80%-osnak találjuk. 12. példa Több adag 3% glükózt 1% élesztőkivonatot, 0.1% dikáliumhidrogénfoszfátot, 0.05% magnézium- 40 szulfát.7 HjO-t, 0,05% káliumkloridot és 0,001% vas(II)szuifátot tartalmazó 100-100 ml-es vizes táptalajt 120 C°-on 20 percig sterilizálunk. Lehűtés után az egyes adagokat Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Flavobacterium aquatile NRRL B-5394, illetőleg 45 Beneckea hiperoptica ATCC 15803 mikroorganizmussal beoltjuk, és 72 óra hosszat 26 C°-on rázás-közben inkubáljuk. Mindegyik fermentlé pH-ját 6,5-re állítjuk be. és a baktériumsejteket a 8. példa szerint összegyűjtve, 200-200 mg szárított sejtet kapunk. A 8. 50 példában használt Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 szárított mikroorganizmus helyett 200-200 mg így kapott szárított mikróbasejtet használunk cefalexin előállítására a következő eredménnyel: 55 Törzs Keletkezett cefalexin Alcaligenes faecalis ATCC 8750 18% Flavobacterium aquatile NRRL B-5393 25% Beneckea hiperoptica ATCC 15803 80% 60 13. példa 4% glükózt, 1,2% élesztőkivonatot, 0.15% dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,05% magnéziumszulfát.7 H2 0-t, 0,05% káliumkloridot és 0,001% vas(II)szulfátot tartalmazó 600 liter 7,0 pH-jú táptalajt beoltunk 30 liter Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 tenyészettel, és 72 óra hosszat 26 C°-on süllyesztetten, levegőztetéssel inkubáljuk. A fermentálás után az 570 liter fermentféből a baktériumsejteket centrifugálással távolítjuk el. A 970 g száraz sejtnek megfelelő eredeti állapotú nedves sejteket 27 liter 6,5 pH-jú 0,1 mólos acetátpuffer•oldatban szuszpendáljuk, majd 1,18 kg 84,8%-os tisztaságú 7-ADCA-t és 30 kg D-fenilglicin-metil•észter- hidrokloridot adunk hozzá, végül a reakciókeveréket 6,5 pH-jú 0,1 mólos acetátpuffer-oldattal 200 literre egészítjük ki. Az inkubálást 37 C°-on 3 óra hosszat keverés közben végezzük. A reakciókeverékben az ultraibolya adszorpciós spektrum mérésével 1,28 kg cefalexini és 80%-os acilezési arányt határozhatunk meg. Az oldatot centrifugáljuk, majd szűrjük. A víztiszta oldathoz 4 kg aktív szenet adunk, és szűrőn való elválasztás után a vizes réteget vákuumban bepárolva 1,03 kg cefalexint kapunk. Kitermelés 64%. A termék tisztasága 98%. ^ SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1 Fljárás 7-ÍD-or-amino-a- fenil-acetilamino)-3-metil-cef-3-ém4-karbonsav előállítására 7-amino-3-metil-eei-3-em- 4-karbonsavból, azzal jellemezve, hogy 7-amino-3-metil- cef- 3-ém4-karbonsavat vizes közegben Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter B-402-2 FERM P-1095 NRRL B-5393, Flavobacterium aquatile NRRL B-5394 vagy Beneckea hyperoptica ATCC 15803 mikroorganizmustörzs fermentlevében vagy sejtjeiben jelenlevő acüező enzim hozzáadása mellett D-fenüglicinnel vagy ennek egy származékával, előnyösen rövidszénláncú alkilészterével reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1971. augusztus 20.) 2. Eljárás 7-(D-o- amino-a-tenil- acetilamino)-3-metil-cef- 3-ém4-karbonsav előállítására 7-amino-3-metil-cef-3-ém- 4-karbonsavból, azzal jellemezve, hogy 7-amino- 3-metil-cef- 3-ém4-karbonsavat vizes közegben Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter B-402-2 FERM P-1095 NRRL B-5393, Flavobacterium aquatile NRRL B-5394, Bacillus megaterium NRRL B-5385 vagy Beneckea hyperoptica ATCC 15803 míkroorganizmustörzsből eredő oldhatatlanul rögzített acilező enzim jelenlétében D-fenilglicinnel vagy annak származékával, előnyösen rövidszénláncú alkilészterével reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1972. január 14.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy oldhatatlanul rögzített acilező enzimként a mikroorganizmusnak egy hordozón adszorbeáltatott fermentlé vét, sejtjeit vagy enzimjét használjuk. (Elsőbbsége: 1972. január 14.) 4. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy kovaföldön, savazott anyagon, aktív agyagon, alumíniumoxidon, kaolinon, kalciumfoszfáton, hidroxiapatiton, karboximetilcellulózon, dietilaminoetilcellulózon, trietilamino- etil-6
