164997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(D-alfa-amino-alfa -fenil-acetilamino)-3-metil-CEF-3-ÉM-4-karbonsav enzimes előállítására

5 164997 6 Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) vagy a 7-aminocefaloszporánsavból való előállítás (3 124 576 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), a 7-fenoxiacetamido- vagy 7-fenil-acetamido- dezacetoxi- cefaloszporánsavészterből való előállítás (3 275 626 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, 696 026 számú belga szabadalmi leírás, 68.06532 számú Holland szabadalmi leírás, 745 845 számú Belga szabadalmi leírás: 1 204 394 számú brit szabadalmi leírás, 746 860 számú belga szabadalmi leírás és 747 118—747 120 számú Belga szabadalmi leírások), vagy a 7-acilamino-dezacetoxicefaloszporánsav enzimes dezacilezése (1 313 390 számú Nagy-Britannia-i szabadalmi leírás). A fenilglicflcsoportnak a 7—ADCA aminocsoportjába való bevitelére D-fenilglicint vagy annak származékát használhatjuk. Ilyen származékok például a következők: D-fenilglicinamid, D-fenilglicilglicin, D-fenilglicilleucin, D-fenil-glicüalanin, D-fenilglicin-metilészter, D-fenilglicin-etilészter stb.: ezek közül az utóbbi kettő előnyös, és legelőnyösebb a fenilglicin-metilészter. Vízben oldhatatlan származék esetében olyan vízben oldható savaddiciós sót lehet használni, amely az acilező enzim reakcióját nem gátolja. A találmány szerinti eljárásban az acilező enzimet termelő mikroorganizmust szerves vagy szervetlen nitrogénforrást, például peptont, húskivonatot, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, száraz élesztőt, szójababfehérje-hidrolizátumot, szójababkivonatot, nitrátot, ammóniumsót stb., szénfoiTást, például melaszt, glükózt, keményítőhidrolizátumot stb. és szervetlen sót, továbbá adott esetben más alkalmas növekedést serkentő anyagot tartalmazó táptalajban aerob körülmények között, 20-35 C°-on, 12-48 óra hosszat tenyésztjük. Az ipari gyártásban általában süllyesztett aerob tenyésztés alkalmazható. A 7—ADCA aminocsoportját acilező enzim általában endoenzimként fordul elő. Az enzim előállítására a mikroorganizmus tenyészetét, a tenyésztés után összegyűjtött eredeti állapotú baktériumsejteket vagy ezek szuszpenzióját lehet az enzimreakcióra felhasználni. Ezenkívül a találmány szerinti eljárásban kémiai vagy fizikai módszerekkel kezelt, például acetonnal, metan< Mai vagy etanollal szárított mikrobasejteket, porlasztva szárított sejteket, őrölt vagy ultrahanggal kezelt sejteket, pufferoldattal vagy cetilpiridiniumkloriddal roncsolt sejteket vagy ismert elválasztó és finomító eljárásokkal, például kisózással, frakcionált kicsapással, dializálással, abszorpciós kromatografálással, ioncserélő kromatografálással vagy őrölt sejtek és roncsolt sejtek gélszűrésével kapott tisztított enzimet vagy szilárd enzimkészítményeket és acilező enzim abszorpciójával előállított oldhatatlanná tett enzimet vagy az enzimet termelő mikroorganizmust olyan iners vivőanyagon, amely nem inaktíválja az alapanyagokat vagy az enzimet termelő mikroorganizmust, lehet alkalmazni, amennyiben az acilező enzim hatékonysága ezekben megmarad. Az acilező folyamat a 7-ADCA és a D-fenilglicin vagy ennek egy származéka között az acilező enzimkészítmény által előidézett reakcióval megy végbe. Általában a 7—ADCA szabad sav alakját 0,1—20 mg/ml, előnyösen 2—5 mg/ml koncentrációban használjuk. A D-fenilglicin szabad sav alakjában kiindulási anyagként nem hatásos, ezért aktív származékát, például savamidját vagy kevés szénatomos alkohollal alkotott észterszármazékát, előnyösen metilészterét használjuk. A fenilglicin-származé-5 kot a 7-ADCA-ra számított általában 2-20-szoros moláris feleslegben alkalmazzuk, de ez a mólarány a reakciókeverékben levő 7-ADCA koncentrációjától függően változhat, és a legelőnyösebb mennyiség a 6~10-szeres moláris felesleg. A reakció hőmérsékletét 10 a legkedvezőbb körülményekre, általában 20-45 C°-ra, előnyösen 30-37 C°-ra lehet beállítani. Nyugalomban végrehajtott, rázott vagy kevert tenyésztés egyformán alkalmazható. A reakció pH-ját 5,5 és 7,5 előnyösen 6,0 és 6,5 között tartjuk. A reakció 15 időtartama a reakciókörülményektől függően változhat, és akkor fejezzük be, amikor a maximális cefalexintermelést elértük. Ha szilárd fázisú enzimkészítménnyel acilezünk, akkor először az acilező enzimet vagy az ezt termelő 20 mikroorganizmust adszorbeáltatjuk a vivőanyagon. Amikor exoenzimet használunk, akkor az acilező enzimet termelő mikroorganizmus tenyészetének szüredékét adszorbeáltatjuk a vivőanyagon. Endoenzim esetében az acilező enzimet {termelő mikroorga-25 nizmus tenyészetéből összegyűjtött eredeti állapotú mikroba sejteket vagy az acetonnal, illetőleg etanollal szárított sejteket adszorbeáltatjuk a vivőanyagon. Vagy másképpen a mikróbasejtekből extrahált acilező enzimoldatot adszorbeáltatjuk a vivőanyagon. 30 A találmány szerinti eljárásban alkalmazott vivőanyagok a mikroorganizmus fajtól vagy a mikrobasejtek acilező enzimének előállításmódjától függően változhatnak, és az enzimet vagy mikrobasejteket adszorbeáló vivőanyagok tulajdonságainak fígyelem-35 bevételével kell kiválasztani azt a vivőanyagot, amely nem hatástalanítja az enzimet, amelyről mosással nem távolítható el az adszorbeált enzim vagy mikrobasejt, amely inaktív minden kiindulási anyaggal szemben, és nem adszorbeálja a keletkezett cefalexint. A vize! 40 enzimoldatok adszorbeálására előnyösen használható anyagok közé tartozik például az aktív alumíniumoxid, a kovaföld, savas agyag, aktív agyag, kaolin, kalciumfoszfát, hidroxiapatit stb. A mikróbasejtek adszorbeálására karboximetilceUulóz, dietilaminoetil 45 cellulóz, trietilaminoetilceUulóz, kovaföld, stb. használható előnyösen. Az enzimnek vivőanyagon történő adszorbeáltatása előtt ajánlatos az acilező enzim pH-jának 50 beállítása. Az adszorpciós műveletet szakaszosan vagy folytonos módon oszlopon lehet végrehajtani. A folyamatos enzimreakció elérésére előnyös oszlopon adszorbeáltatni. A vivőanyag mennyisége a mikrobasejtek mennyiségétől, a tenyészet szüredékének 55 térfogatától, az enzim titerétől és a vivőanyag adszorbeálóképességét51 függően változhat. A szakaszos adszorpcióban a vivőanyag mennyisége általában a tenyészet szüredékére számítva 5—15 súly/térfogat vagy eredeti állapotú sejtre számítva 5—20-szoros 60 térfogat lehet. Az oszlopos műveletben a vivőanyaggal töltött oszlopot vízzel vagy az enzim legkedvezőbb pH-jával azonos pH-jú pufferoldattal nedvesítjük, a fermentlét vagy az enzimoldatot átfolyatjuk, majd az oszlopot vízzel vagy pufferoldattal mossuk, hogy 65 oszlopon elválasztott szilárd enzimkészítményt kapjunk. Amikor mikróbasejteket adszorbeáltatunk a vivőanyagon, a vízben vagy pufferoldatban levő 3