164979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás benzodiazepin-származékok előállítására mikrobiológiai transzformációval
15 164979 16 1- ((3-etilaminoetil)- 3-hidroxi-5-(o-fluorfenil)-7-klór- l,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-on, l-(ß- dietilaminoetil)- 3-hidroxi- 5-fenil-(o-fluorfenil)- 7-klór- 1,3-dihidro- 2H-1,4- benzodiazepin-2-on. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal részletesen ismertetjük, anélkül azonban, hogy a találmány oltalmi körét kizárólag a példákban megadottakra korlátoznánk. /. példa A Streptomyces transformans FERM P 947 spóraszuszpenziójával 500 ml térfogatú Sakaguchi- 15 lombikban sterilezett 100 ml alábbi összetételű táptalajt oltunk: glükóz 5 g. élesztőkivonat 0.5 g. szójaliszt 0.5 g. KHjPO* 0.1 g. K2 HP0 4 0,2 g, FeS04 .7H 2 0 0.1 g. csapvíz 100 ml. A táptalaj pH-ját 7.0-re állitjuk be. 20 A táptalajt 30 CJ hőmérsékleten rázógépen inkubáljuk. 24 órás tenyésztés után 2 ml inokulummal húsz darab, 100-100 ml fenti összetételű táptalajt tartalmazó Sakaguchi-lombikot oltunk. További 24 25 órás inkubáció után mindegyik táptalajhoz 100 mg, 2,0 ml etanolban oldott 1-ciklopropil-metil- 5-fenil-7 -klór- 1,3-dihidro-2H- 1,4- benzodiazepin-2-ont adunk. 7 napos inkubáció után a fermentlevet kloroformmal extraháljuk, majd csökkentett nyoma- 30 son szárazra desztilláljuk. Az 1,93 súlyú desztillációs maradékot kloroform, aceton és etanol 17:2:1 arányú elegyében oldjuk, majd szilikagél oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást a fenti oldószereleggyel végezzük, amikor 35 0,50 g 159-161 C° olvadáspontú 1-ciklopropilmetil -3- hidroxi-5-fenil- 7-klór- l,3-dihidro-2H- 1,4-henzodia/cpin-2-ont és 1,10 g 203-204 C° olvadáspontú [a]^y = +10,4 (c = 0,5, metanolban) optikai iorgatoképességű 3-hidroxi- 5-fenil-7-klór- 1,3- 40 dihidro- 2H- l,4-benzodiazepin-2-ont kapunk. A fenti eljárással előállított termékek infravörös spektruma azonos az 1-ciklopropilmetil- 3-hidroxi-5-fenil-7-klór- 1,3-dihidro-2H- 1.4-benzodiazepin- 2-onnal, illetve a 3-hidroxi-5-fenil- 7-klór- l,3-dihidro-2H- 45 1,4-benzodiazepin-2-ónnal. 2. példa 50 Streptomyces benzodiazepinicus FERM-P 949 törzset tenyésztünk 28 C° hőmérsékleten, az 1. példában megadott táptalajon. 24 órás inkubáció után 2-2 ml tenyészettel Sakaguchi-lombikokban (30 db) 55 100-100 ml, az 1. példában megadott táptalajt oltunk. Megfelelő növekedés után minden táptalajhoz 100 mg, 2 ml etanolban oldott 5-(2'-fluorfenil)- 7-klór-1,3-dihidro-2H- l,4-benzodiazepin-2-ont adunk; 5 60 napos inkubáció után a tenyészetet kloroformmal extraháljuk, majd az 1. példában leírt eljárást megismételve 2,27 g nyers kristályos anyagot kapunk. A nyers kristályos anyagot 20 ml kloroformban oldjuk, majd 2,5 cm x 80 cm nagyságú Sephadex g5 LH-20 oszlopon kromatografáljuk. Az át nem alakult szubsztrát kloroformmal eluálható. majd etanolos elucióval 3-hidroxi-5- (2'-fluorfenü)-7-klór-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin- 2-ont kapunk. Az etanolos eluátumból kapott desztillációs maradékot etanolból kikristályosítjuk. A 3-hidroxi-5-(2'-fluorfenil)-7-klór- l,3-dihidro-2H- 1.4-benzodiazepin-2-on fizikokémiai tulajdonságai: olvadáspont: 193-194 C° |(*£4 = -31,0 (c = 0,58 DMSO). Flemanalízis: számított f 59,13 H 3,31 N 9,19 Cl 11,63%; mért: C 59,15 H 3.36 N 9,09 Cl 11,41. 3. példa Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy a fermentációt Streptomyces takarazukaensis FERM-P 943 törzzsel végezzük, és a tenyészethez l-metil-5-fenil- 7-klór- l,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-ont adagolunk. A terméket az 1. példa szerinti módon extraháljuk és a 2. példa szerinti módon tisztítjuk, amikor etanolos kikristályosítás után 1-metil- 3-hidroxi-5-fenil- 7-klór- l,3-dihidro-2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont (olvadáspont 118-120 C°) és 3-hidroxi-5-fenil-7-klór- l,3-dihidro-2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont kapunk 2:5 súlyarányban. A terméket infravörös spektrum-analízissel azonosítjuk. 4. példa Streptomyces calvus FERM-P 944 az 1. példa szerinti módon készült inokulumával húsz 100-100 ml, az 1. példában megadott összetételű táptalajt tartalmazó tenyésztet oltunk 48 órán át. 28 C° hőmérsékleten tenyésztjük az organizmust, majd mindegyik táptalajhoz 100 mg, 2,0 ml etanolban oldott l-metil-5-fenil- 7-nitro- 1.3-dihidro-2H- 1,4-benzodíazepin-2-ont adunk. * napon át inkubáljuk a tenyészeteket, majd az 1. példa szerinti módon extraháljuk. A 2. példa szerinti módon tisztítjuk a nyers kristályos terméket, amikor 0.23 g 201-202 C° olvadáspontú l-metil-3-hidroxi- 5-fenil-7-nitro- 1,3-dihidro- 2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont és 1.61 g 199-201 C° olvadáspontú 3-hidroxi- 5-fenil-7-nitro-1.3-dihidro-2H- 1.4-benzodiazepin-2-ont kapunk. A termékek infravörös spektruma azonos a megfelelő vegyületek spektrumával. 5. példa Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy Streptomyces fimicarius FERM -P 945 törzset tenyésztünk és a tenyészetekhez szubsztrátként l-metil-5-fenil- 7-trifluormetil-1.3-dihidro-2H- 1.4-benzodiazepin- 2-ont adunk a növekedés kezdeti szakaszában. A tenyészlét az 1. példában megadott módon extraháljuk. A nyers terméket a 2. példában megadott eljárással különítjük el és tisztítjuk, amikor 183-185 (' olvadáspontú l-metil-3-hidroxi- 5-fenil-7- trifluormetil l,3-dihidro-2H- l,4-benzodia/epin-?-ont és 189-191 C° olvadáspontú 3-hidroxi 5-fenil-7-tri-8
