164703. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés kémiai, különösen enzimes analizisek elvégzésére
3 164703 4 Az eddig használt mérési módszer másik aiapvető korlátja a minták térfogata. A gyakorlatban még kezelhető legkisebb küvettákba is legalább 0,3 milliliter vizsgálandó oldat betöltése szükséges. Célunk a találmánnyal olyan eljárás és berendezés kialakítása, amelyekkel az ismert fotometrikus és fluorimetrikus reakciók alkalmazása mellett enzimaktivitások, szubsztrátum és koszubsztrátum koncentrációk mérése rendkivül egyszerű technikai eszközökkel, igen kis mennyiségű anyag felhasználásával, fokozott hatékonysággal (egy próba kiméréséhez szükséges idő csökkenése) és igen kis költséggel tetszőleges reakciófeltétel mellett megvalósítható. Természetesen ugyanez vonatkozik a nem enzimes analízisekre is. A kitűzött feladatot a találmány szerinti eljárással ugy oldjuk meg, hogy a vizsgált anyag és a reagens keverékét mindkét közeg mikroliter nagyságrendű mennyiségéből állitjuk elő, és a keverést az egymás mellett elhelyezett közegek együttes rezgetésével végezzük. Ily módon lehetővé válik 5 mikroliternél kisebb mennyiségit anyag kvantitatív és kvalitatív vizsgálata. Ehhez legalább az egyik közeg oldott állapotban kell legyen. Természetesen a reagens általában több komponensből áll. A reakció körülményeinek változtatásával lehetővé válik egy megadott tetszőleges küszöbértéket meghaladó eredményeket pozitivnak vagy negatívnak tekinteni. Vizsgálatonként két küszöbérték állapitható meg. A szűrőpapírra felvitt anyagot fotométer vagy fluoriméter segítségével átvilágítással vagy ráeső fényben kvantitativen kiértékeljük. Két kemény lapot, amelyek zsákfuratszerü üregekkel vannak ellátva, egymásra helyezünk ugy, hogy a kamrák zárt reakcióteret képezzenek. A kamrák körül gyürü alakú hornyok vannak. Az egymásra helyezett lapokat szorítócsavar és két szorítókengyel segítségével szorosan összepréseljük, és vibrátorban rögzitjük. Két további lapban, amelyek optikailag nem átvilágítható anyagból vannak, olyan átmenő furatokat készítünk, amelyek a próbaalapok kamráinak megfelelően vannak elhelyezve. A találmány szerinti eljárás gyakorlati jelentőségét az a tény is növeli, hogy a biokémiai analízis minden területén az enzimes analízisekhez igen nagy számú mérést kell végezni. Ez a helyzet például az enzimgyártás területén végzendő preparativ munkáknál, az enzimtísztitásnál és molekulasúly meghatározásnál, a klinikai biokémia és a megelőző vizsgálatok keretén belül végzett diagnosztikai és epidemiológiai vizsgálatoknál és számos egyéb helyen. A találmány szerinti eljárással lehetővé válik nagyszámú mérés minimális idő- és anyagfelhasználás mellett történő elvégzése. A méréshez szükséges reagens mennyiségekét nagyságrenddel csökken. Minthogy a felhasznált reagensek túlnyomó többsége meglehetősen drága biokémiai termék, az egy-egy vizsgálatsorozat alatt elérhető megtakarítás igen tetemes összeg. Ugyancsak nagy megtakarítást jelent az eljárás foganatosításához szükséges berendezés csekély ára, valamint a jelentős munkaidő megtakarítás is. Következésképpen a találmány szerinti eljárással és berendezéssel kis és gyengén felszerelt laboratóriumokban nyílik lehetőség enzimes analízisek elvégzésére. Célszerű a vizsgált anyagot és a reagenst fóliában kezelni. Ilyen, a próbalap kialakításának meg-5 felelő alakú fólia felhasználásával a közegeket tetszőleges formában és összetételben lehet adagolni, azok a próbalapokkal nem érintkeznek, és nem szükséges pipettázás az adagoláshoz. A fóliák használat után eldobhatok. 10 A találmány további részleteit kiviteli példán, rajz segítségével ismertetjük. A rajzon: az 1. ábra a találmány szerinti berendezés vibrá-15 torra erősítve, a 2. ábra a találmány szerinti berendezés felülnézete nyitott állapotban, a 3. ábra a prőbalapok metszete, a 4. ábra szürőpapir a próbafoltokkal, az 20 5. ábra a találmány szerinti próbalapok egy másik kiviteli alakja. A - célszerűen műanyag - 1 és 11 próbalapok zsákfurat szerus 2, 12 üregekkel vannak ellátva. 25 A 2, 12 üregek térfogata körülbelül 10 mikroliter, egymástól mért távolságuk körülbelül 1 cm. A 2, 12 üregek körül 3, 13 gyürü alakú hornyokvannak. A 4 szorítócsavar és a két 5 szorítókengyel segítségével az 1 és 11 próbalapokat ugy kell össze-30 szorítani, hogy mind a 2, 12 üregek, mind pedig a 3, 13 gyűrű alakú hornyok zárt teret alkossanak. Mindkét 1, 11 próbalapon tetszőleges számú 2, 12 üreget lehet kialakítani. A legalkalmasabbnak a 20-120 üreggel ellátott berendezések bizonyultak. 35 A 1, 11 prőbalapok 2, 12 üregeibe mechanikus mikropipettával vagy mikrobürettával lehet az anyagot (5 mikrolitert vagy ennél kisebb mennyiséget) betölteni. A reakció valamennyi 2, 12 üregben egyszerre indul meg, miután az 1, 11 próba-40 lapokat egymásra helyeztük és az anyagokat a 6 vibrátor keverni kezdte. Az 1, 11 próbalapokat két vezetőcsap tartja a megfelelő helyzetben és a 4 szorítócsavar szoritjaegymáshoz. Az egyes próbák összekeveredését a 3, 13 gyürü alakú hornyok 45 akadályozzák meg. Lezárás és összekeverés után a berendezést meghatározott ideig megfelelő hőmérsékleten tartják. Ennek elteltével az 1, 11 próbalapokat szétnyitják és 7 szűrőpapírt helyeznek közéjük. Ezután az 1, 11 próbalapokat ismét 50 egymásra helyezik és a keveréket rövid rázás vagy rezgetés után a 7 szűrőpapírra viszik át, ahol az 8 foltokat képez. Az analizis eredeményeinek kiértékelését NAD 55 illetve NADP reakciókkal végzik a redukált alakok fluoreszcenciája alapján, ultraibolya lámpa alatt. Színezékreakciók esetén a 8 foltok színének intenzitása indikátorként használható. Alkalmaznak olyan papírokat is, amelyeket színes előhívó oldattal ke-60 zeltek, vagy indikátort permeteztek rájuk. A kisérlet körülményeit ugy választják meg, hogy az enzimeknek vagy szubsztrátumoknak meghatározott mennyiségen felüli jelenléte fluoreszcenciaként, a fluoreszcencia eltűnéseként vagy elszíneződésként 65 jelentkezik. A találmány szerinti eljárásban ez a 2
