164639. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszálú, interferon- indukáló hatású poliriboinozinsav-poliribocitidilsav komplexek előállítására
164639 ugyanakkor toxicitásuk csekély. E kis molekulasúlyú rIn iCn komplexeket úgy állithatjuk elő, hogy a kezeletlen komplex vegyületeket hanghuBámok hatásának tesszük ki. A kezelést általában úgy végezzük, hogy az rIn iC n komplex 5 körülbelül 1 mg/ml koncentrációjú oldatát 1,93 cm hosszúságú szondával felszerelt, 210 Watt teljesítményű generátorral gerjesztett hanghullámok hatásának tesszük ki. A besugárzást rendszerint hűtés közben végezzük. A kezelés ideje az elérni 10 kívánt depolimerizáció mértékétől függ. A fenti teljesítményű generátor alkalmazása esetén a besugárzást rendszerint 0,5-16 percig végezzük. A hanghullámokkal kezelt rIn arC n oldatok is vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy ha a besugárzás idejét növeljük, az oldat relatív viszkozitása közel exponenciálisan csökken. Azt tapasztaltuk, hogy még a 16 percig kezelt oldatok is jelentős interferon-indukáló hatással 20 rendelkeznek. A fenti módon lebontott rIn iCn komplex interferon-indukáló hatása nyúlon alig változott, a komplex azonban sejttenyészetben szájnyálkahártya gyulladásos (VSV) vírusfertőzéssel szemben, valamint egéren egér-pneumónia-vírus 25 (PVM) vírusfertőzés ellen némileg kisebb mértékű védőhatást idézett elő. A találmány szerint az rIn iC n komplexeket kis - mintegy 1,7« 103 - 3,7« 10* átlag-30 molekulasúlyú- rln és rC n komponensekből is előállíthatjuk. A kismolekulasúlyú homopolimereket előnyösen inozin-difoszfát, illetve dtidindifoszfát irányított enzimes polimerizádójával állítjuk elő. A polimerizációban enzim-katalizátor- 35 ként polinukleotid-foszforilázt (PMP-áz) alkalmazunk. A viszonylag kis átlagmolekulasúlyú rCn homopolimereket úgy is előállíthatjuk, hogy a nagy -mintegy 8*106 - molekulasúlyú rC n polimereket a korábbiakban ismertetett módon 40 hanghullámok hatására lebontjuk. A mintegy 8*10* molekulasúlyú rCn homopolimert úgy is lebonthatjuk, hogy a polimert ribonukleázzal, előnyösen hasnyálmirigyből elkülönített ribonukleáz-A-val kezeljük. Ha a fenti eljárásban körül- 45 belül 1,9-105 átlagmolekulasúlyú, 4,1 relatív viszkozitású (víz = 1,0) rCn homopolimert 30 percig ribonukleázzal kezelünk, körülbelül 1,08 relatív viszkozitású, részben lebontott rCn polimert kapunk. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa A komplex körülbelül 200 ml vízzel készített, 1 mg/ml koncentrációjú oldatát hűtés közben hanghullámok hatásának tesszük ki. A besugárzás idejét változtatjuk. A besugárzást 1,93 cm hosszú szondával felszerelt 210 Watt teljesítményű hanggenerátorral, például 20000 Hz-es Biosonic III típusú generátorral végezzük. Meghatározzuk az egyes kísérletekben kapott, részben lebontott rIn iCn komplexet tartalmazó oldatok relatív viszkozitását, ülepedési állandóját, átlagmolekulasúlyát, termikus átalakulási középhőmérsékletét (Tm C°), százalékos hiperkromicitását, relatív ribonukleáz-érzékenységét és ultraibolya abszorpciós spektrumát. Az észlelt értékeket az 1. táblázatban közöljük. A relatív viszkozitást Ostoraid-viszkoziméterrel mértük. A viszkoziméter kifolyási ideje víz esetében, 25 C°-on 120 másodperc. Az ülepedési állandót ultraibolya elemzőberendezéssel felszerelt Spinco Model E típusú ultracentrifugában határoztuk meg. A molekulasúlyt az ülepedési állandóból számítottuk ki az alábbi egyenlettel: M'l.lSXlO'xS^.w. (Az egyenletben S20,w *z ülepedési állandó, M az átlagmolekulasúly.) A százalékos hiperkromicitást az optikai sűrűség hőbomlás alatti százalékos növekedésével fejeztük ki. A Tm-értéket és a ribonukleázérzékenységét a fenti belga szabadalmi leírásban ismertetett módszerrel határoztuk meg. A táblázat adataiból kitűnik, hogy a besugárzás idejét növelve, csökken az átlag-molekulasúly. A csökkenés exponenciális függést mutat. 50 1. táblázat ideje, perc Relatív viszkozitás S20,w Átlagos molekulasúly TmC° Hiperkromicitás, < Relatív ribonukleázérzékenység El% 265 m/i 0 3,9 21,1 7,8 • 106 63,5 71,2 100 140 0,5 2,1 16,9 4,2 • 106 62,5 70,7 114 140 1,0 1,7 13,7 2,3- 106 62,0 71,7 115 139 3,0 1,4 11,1 1,2- 106 62,5 67,0 117 140 4,0 1,3 9,3 7,4 • 10 s 61,5 67,0 129 139 6,0 1,2 8,5 5,6 • 10 s 61,0 62,0 143 139 12,0 1,1 7,9 4,6 • 10 s 60,0 59,0 147 143 16,0 1,05 6,7 2,8 • 10' 58,5 49,0 220 145 2
