164499. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 22 750 RP trombolitikus enzim előállítására
164499 21 22 hullámszámokat (alsó skála), az ordinátára az optikai sűrűséget vittük fel. A következő táblázatban megadjuk a termék infravörös spektrumának legfontosabb sávjait. 3410 n.e. 1445 k. 940 k. 3300 váll. 1385 k. 810 gy. 3070 váll. 1330 .n.gy. 735 váll, 3015 váll. 1300 gy. 690 váll. 2950 k. 1235 k. 650 váll. 2920 k. 1145 gy. 610 váll. 2860 gy. 1120 n.gy. 550 e. 2840 váll. 1090 váll. 480 váll. 1645 n.e. 1070 e. 460 váll. 1535 n.e. 1045 k. 420 váll. n.e. = nagyon erős, e = erős, gy. = gyenge, n.gy. = nagyon gyenge. Forgatóképesség (0,5%-os vizes oldatban meghatározva) : [ta ]23 D== _i 0) 3 + 0) 3°; [a]23 436 = —17,7 ±0,3°. A következő táblázat mutatja a termék hatását különböző alapanyagokon. Aktivitás Reakció Alap (K.E./g) Proteolízis kazein 7 000 azokazein 15 700 zselatin 1000 Fibrinolízis ökörvérrög-fibrin 2 500 házinyúlplazma-vérrög 4100 kutyaplazma-vérrög 200 000 Észterolízis BAEE 3 000 ATEE 500 3. példa: Az 1. példa a)—e) szakaszai szerint előállított, de 2400 K.E./g titerű 22,8 g terméket 480 ml desztillált vízben oldjuk; az oldat pH-ja 7,4. A következő műveleteket +4°-on végezzük. 17 cm magas, 15 cm átmérőjű desztillált vízzel itatott cellulóz oszlop tetejére felvisszük az oldatot, és desztillált vízzel 950 ml/óra sebességgel eluáljuk. Az eluátum optikai sűrűségét „Uvicord L. K. B." analizátorral 280 nm-nél folyamatosan mérjük. A kapott diagramon egy aszimmetrikus csúcs felel meg az enzimnek, míg a termékben levő 6,9-diamino-2-etoxi-akridinlaktát nyomok a cellulózon rögzítve maradnak. Az abszorbeált frakcióknak megfelelő eluátumot (6,9 liter) összegyűjtjük, és 2 Torr nyomáson és 25°-ot meg nem haladó hőmérsékleten 480 ml-re bepároljuk. 475 ml koncentrátumot 205 ml —10°-ra hűtött izopropanollal hígítunk, és a kapott oldatot felvisszük izopropanol és 30 tf% alkoholt tartalmazó víz elegyével itatott cellulózzal töltött oszlop tetejére. Az oszlop átmérője 15 cm, és 600 g száraz cellulózt tartalmaz (a cellulóz magassága az oszlopban 7 cm). Ugyanilyen eleggyel óránként 450 ml sebességgel eluálunk, és az optikai sűrűséget „Uvicord L.K.B." analizátorral 280 nmnél folyamatosan mérjük. Az eluátumot 20 mles frakciókként gyűjtjük. A kapott diagramon 5 két aszimmetrikus csúcs látható. A második csúcs megjelenése után i(körülbelül 10 liter eluátum) az eluáló elegyben a víz arányát fokozatosan 100%-ig növeljük (a változó összetételű eluáló folyadék összes térfogata 22,5 liter), majd 10 az eluálást desztillált vízzel befejezzük, amikor a kapott frakciók (körülbelül 16 liter) 280 nmnél gyakorlatilag már nem abszorbeálnak. A víz által eluált utolsó abszorpciós csúcs a 950 és 1150 frakciók között van. Ezt a 11,6 liter 15 frakciót összegyűjtjük, és 2 Torr nyomáson 150 ml-re bepároljuk, majd liofilizáljuk. Így 4,5 g 6400 K.E./g titerű terméket kapunk. A? elektroforézises elemzés szerint ez a termék 60% aktív anyagot tartalmaz. A fent leírt körülmények között előállított 6400 K.E./g titerű 1,5 g terméket 15 ml +4°on hűtött 2 • 10~4 mólos nátriumklorid oldatban oldjuk. Ezt az oldatot ugyanezzel az oldószerrel -|-40 -an egyensúlyba hozott Biogel—P.60 oszlop tetejére visszük. Az oszlop átmérője 7,5 cm, és 122 cm magasságban tartalmaz duzzasztott gélt (ez körülbelül 280 g száraz gélnek felel meg). Ugyanezzel az oldószerrel 120 ml/óra sebességgel eluálunk. Az eluátumot körülbelül 35 ml-es frakciókként gyűjtjük, és optikai sűrűségét „Uvicord L. K. B." analizátorral 280 nm-nél folyamatosan mérjük. A kapott diagram fő részén egy aszimmetrikus csúcs van vállrésszel az eluálás kezdetén, ami abszorbeáló szennyezés jelenlétére mutat. 20 25 30 35 Az abszorbeáló frakciókat összegyűjtjük, de kiküszöböljük azokat, amelyek a fatermékkel együtt eluált szennyezéseknek felelnek meg, 40 vagyis a 65—80. frakciókat (580 ml), majd 2 Torr nyomáson 100 ml-re bepároljuk, és liofilizáljuk. Így 387 mg 11 000 K.E./g titerű terméket kapunk, és ez az elektroforézises elemzés szerint 45 csak egyetlen proteines alkotórészt (95%-nál több aktív anyagot) tartalmaz. 50 55 60 65 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás a 22 750 RP elnevezésű trombolitikus enzim előállítására egy Streptomyces családba tartozó mikroorganizmusnak egy asszimilálható szénforrást és asszimilálható nitrogénforrást tartalmazó táptalajon aerób körülmények között való tenyésztésével, majd a termelt enzimnek a fermentléből a proteinek elkülönítésére és f rakcionálására általánosan használt módszerek alkalmazásával történő extrahálásával és a hatóanyag dúsulásának ellenőrzése alapján való frakcionálásával azzal jellemezve, hogy az enzim előállítását Streptomyces venetus DS 24 288 (NRRL 3987) törzs tenyésztésével végezzük. (Elsőbbsége: 1971. július 27.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganato-11
