164499. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 22 750 RP trombolitikus enzim előállítására
3 164499 4 Az 1. táblázatban közöljük az új enzim fontosafob abszorpciós sávjait. 1. táblázat 3280 n.e. 1515 k. 1365 váll. 1040 n.gy. 3200 váll. 1490 váll. 1330 n.gy. 927 n.gy. 3060 k. 1465 n.gy. 1303 e. 920 n.gy. 3040 n.gy. 1455 n.gy. 1280 váll. 825 n.gy. 2980 váll. 1445 k. 1235 k. 735 n,gy. 2960 k. 1435 váll. 1165 gy. 695 gy. 2935 gy. 1418 váll. 1145 n.gy. 2880 váll. 1405 gy. 1110 k. 530 gy. 265Ö" váll. 1398 váll. 1075 k. 470 váll. 1650 n.e. 1385 k. 1055 n.gy. 430 n.gy. 1535 n.e. 1375 váll. n.e. = nagyon erős, k. = közepes, gy. = gyenge, n.gy. = nagyon gyenge. Forgatóképesség (0,5%-os vizes oldatban meghatározva) : M20 D = — 14 + 0,5°; M20 436 =-29,2 ±0,6°; M20 365 =-53,5 ±0,8°. A 22 750 RP enzimre jellemző a cellulózacetát-gélen különféle pufferekkel végzett elektroforézis során tanúsított viselkedése: citromsav-din átriumioszfát: pH = 2,2, ^=0,09; ecetsav-nátriumacetát: pH = 4.0, ^ = 0,1; 5,5-dietilbarbitursav i(barbital): pH = 8,6, ^=0,075; nátriumkarbonát-glicin: pH = 9,6, /< = 0,1. (ju= ionerősség). A meghatározás kolorimetriásan vagy a proteolitikus hatás mérésével hajtható végre. Például 4,0 pH-nál az aktív faktor a katód felé vándorol: az elmozdulás 250 volt állandó feszültségnél 2 óra alatt 5 mm (6 és 15 milliamper között változó áramerősségnél). A 22 750 RP enzim hatása sokféle fehérjével, különösen kazeinnel, hemoglobinnal és fibrinnel szemben érvényesül. Nagyon gyenge a hatása benzoilarginin-etilészterre (BAEE), és egyáltalán nem hat acetiltirozin-etilészterre (ATEE). A kazeinre gyakorolt hatást a Kunitz által tripszin meghatározására kidolgozott...,[módszer [M. Kunitz. J. gen. Physiol. 30, 291 (1947)] alkalmazásával állapítottuk meg. A hidrolízis folyamán felszabadult triklórecetsavban oldható peptideket spektrofotometrálással, az optikai sűrűséget 280 nm-nél mérve határoztuk meg. Az enzimaktivitás Kunitz-^egységekben (K.E.) fejezhető ki: Kunitz szerint egységnyi enzim az a mennyiség, amely annyi oldható peptidet szabadít fel, amennyi elég arra, hogy a triklóraoetátos szüredék 280 nm-nél mért optikai Sűrűsége egy pare alatt 1000-rel növekedjék. A 2. táblázatban a találmány szerint előállított 22 750 RP enzimmel kapott eredményeket összehasonlítjuk két kristályos proteolitikus en-20 zimmel, a tripszinnel és a kimotripszinnel kapott eredményekkel. 10 15 25 30 A következőkben ezeket az eredményeket diagramban szemléltetjük. (a) reakció 8,0 pH-nál 37 >C°-on, a szubsztrátum koncentrációja: 5 g/liter, (b) reakció 7,5 pH-nál 37 C°-on, a szubsztrátum koncentrációja: 12,5 g/liter, (c) reakció 7,5 pH-nál 37 C°-on, zselatinhártyán, (d) reakció 7,4 pH-nál 37 C°-on, a fibrinogen koncentrációja: 10 g/liter, (e) reakció 7,5 pH-nál 37 C°-on, a plazma koncentrációja: 400 ml/liter, 35 (f) reakció 7,4 pH-nál 37 C°-on, a plazma koncentrációja: 200 ml/liter, (g) reakció 7,4 pH-nál 37 C°-on, a plazma koncentrációja: 200 ml/liter, (h) reakció 7,7 pH-nál 25 lC°-on, a szubsztrátum koncentrációja: 5-10-4 mól, (i) reakció 7,0 pH-nál 25 C°-on, a szubsztrátum koncentrációja: 5-10-4 mól. 40 A trombolitikus és fibriolitikus aktivitást la-45 boratóriumi állatkísérletek eredményei bizonyítják. 2. táblázat Reakció Alap Aktivitás K.E./g 22 750 RP tripszin kiniotripszin (a) 11 000 4 000 4 800 (b) 28 800 13 300 3 250 (c) 800 4 000 100 (d) 6 780 29 000 4 000 (e) 3 800 2 000 2 700 (f) 500 000 20 000 10 000 (g) 200 000 10 000 4 000 (h) 17 34 000 300 (i) 0 2 000 116 000 proteolízis kazein azokazein zselatin fibrinolízis ökörvérrög-fibrin házinyúlplazma-vérrög kutyaplazma-vérrög emberplazma-vérrög észterolízis BAEE ATEE
