164498. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoprotein előállítására
164498 11 12 elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező gyűrű; egy /?i-globulin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező gyűrű, végül egy aa-globulin-szerű elektroforetikus mozgékony-5 sággal rendelkező gyűrű: Az anti-IGG, -IGA- és -IGM immunszérumokkal végzett vizsgálatok szerint a frakció a háromféle típusú immunoglobulint nyomokban sem tartalmazza. 10 pH =' 3,9 értékű közegben végzett elektroforézissel anódos mozgékonysággal rendelkező zóna nem mutatható ki. Hígított emberi vértszérum szűreses dializálá-I5 sa során olyan szérum-komponens-frakció marad vissza, amely izolált tengerimalac-ileumon csökkenti a hisztamih izommerevítő hatását. Ez a frakció 100 000-nél nagyobb molekulasúlyú fehérjeként viselkedik. Ha az immunoglobülinokat 20 ammóniumszulfáttar végzett előzetes kisózással eltávolítjuk, ménibránpolarizáció lép fel kevésbé kifejezett, de még észlelhető mértékben, és jelentős albumin-retenció figyelhető meg. Vizsgálataink szerint csak a második frakcióban kapott anyag csökkenti a hisztamin izommerevítő hatását izolált teingerimaac-ileumon. A frakció jelentős hisztaminopexiás hatással rendelkezik. 2 nanogramm poralakú liofilizált termék aktivitása felel meg 1 hisztaminopexiás egységnek. Az anyag cellulózacetáton, pH = 8,6 értéken végzett elektroforézis alapján egységes. A szennyezett amid egyetlen, prealbumin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező anyagot tartalmaz. Elektromos koncentrálás alapján a termék izoelektromos pontja pH = 3,90 és 4,10 közötti érték. Az emberi vérszérumból, illetve a sertés-vérszérumból elkülönített frakciók teljes mértékben azonosak egymással. E két frakció a farmakológiai kísérletek szerint azonos aktivitással rendelkezik. Emberi antiszérum immunoszérum jelenlétében, Ouchterlony-módszerrel nem mutatható ki gyűrűképződés a lerakódott sertés^fehérje körül. Az emberi antiszérum immunoszérum nincs hatással a sertés-szérumfehérjére, azaz az immunológiai elemzés pontossági határain belül nincs antigén kölcsönhatás a kétféle típusú fehérje között. 3. példa XM 100 A membránon végzett tisztítás 2,54 g fehérjét — amelyet 2,4—3,3 mólos ammóniumszulfáttal csaptunk ki — 12 liter vízben oldunk, és az oldatot állandó keverés közben 100 liter desztillált vízzel szemben dializáljuk. A műveletet +4 C°-on, 0,5 bar nyomáson végezzük. A kapott frakció aktivitását farmakológiai úton meghatározzuk, majd biuret-módszerrel azonosítjuk a fehérjéket, Végül elektroforetikus és immunoelektroforetikus úton meghatározzuk a frakció összetételétj Eredmények A kapott minta és a kiindulási szérum 1 /ug-ra vonatkozó fajlagos aktivitásának összehasonlításából meghatározható a dúsítás foka. Ha 1 /«g anyag fajlagos aktivitása adott érték (X'), az egységszáimot ai 1/X' tört adja meg. X>g 1/X' mg Kiindulási iszérum 30X10~3 33X10 3 Kapott frakció IX KT3 10 6 Az adatokból látható, hogy az eljárással 33-szorös dúsítás érhető el. Az 'emberi antiszérüm immunoszérummal szemben végzett immuhoelektroforézis során az alábbi frakciók mutathatók ki: nagymennyiségű, albumin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező frakció; két a'i-globulin-szerű 25 Karboximetilcellulózón végzett kromatografáláa 0,1 mólos acetát-pufferoldat (pH = 4,2) 0,1 mólos acetát-pufferoldat (pH = 4,8) 0,1 mólos acetát-pufferoldat (pH = 5,5) 1 mólos nátriumklorid-oldat 0,02 mólos nátriumhidroxid-oldat. A puffercsere akkor történik, amikor az eluátum 240 nm-nél már nem mutat elnyelést. A frakciókat csoportosítjuk, pH = 7,0 értékre semlegesítjük, dializáljuk, betöményítjük és fagyasztva szárítjuk. Az így kapott mintákat farmakológiai és immunoelektroforetikus vizsgálatoknak vetjük alá. Eredmények; A kapott öt frakció közül csak az az egyetlen frakció mutat hisztaminopexiás hatást, amely a kationcserélőn meg nem kötött anyagot tartalmazza. A) Sertésszérum Kísérleti módszer: 30 30 g mikroszemcsés (52), előre duzzasztott karboximetilcellulózt 0,1 mólos, 4,2 pH-értékű acetát-pufferfoan diszpergálunk. Az egyensúly beállása után a kapott gélt 18 cm magasságú, 1,5 am átmérőjű kromatográfiás oszlopba tölt-35 jük. 500 mg, a szűreses dializálás során visszamaradt anyagot a fenti pufferoldatban oldunk, és 24 órán át a tiszta pufferoldattal szemben dializáljuk. Az eluátum optikai sűrűségét 240 nm hullám-40 hosszon meghatározzuk, és az eluátumot frakciókba gyűjtjük. Az eluátum átfolyási sebességét szivattyúval 60 ml/óra értéken tartjuk. A minta felvitele után az oszlopon egymás után a következő puff er oldatokat áramoltatjuk 45 át: 55 60 6
