164498. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoprotein előállítására
164498 7 8 juk el perisztaltikus működésű szivattyú segítségével. Az eluátumot az optikai sűrűségnek megfelelő frakciókra bontjuk szét. Az eluátuimfrakciók optikai sűrűségét 280 ram hullámhoszszon határozzuk meg. A mintát ezután — a szacharóz eltávolítása céljából — rendszerint vízzel szemben diaBzáljuk, majd a frakciókat fagyasztva szárítjuk. A fenti eljárással két frakciót különítünk el. A egyik frakció a prealbuminok elektroforetikus mozgékonyságának megfelelő mozgékonyságú anyagot, míg a másik a /?-globulinok elektroforetikus mozgékonyságának megfelelő mozgékonyságú anyagot tartalmaz. A két frakció közül csak az előbbi csökkenti a hisztamin izommerevítő hatását izolált tengerimalac-iléumon. Normál emberi antiszérum immunszérummal szemben végzett immunoelektroforézis során csak egyetlen görbe jelenik meg; a mozgékonyság azonos az előbb meghatározottal. Ez a jelenség — az immunokémiai vizsgálati módszerek pontossági határain belül — arra utal, hogy az aktív frakció egyetlen molekulatípust tartalmaz. A második frakció — a hordozóanyagként felhasznált szilárd vagy folyékony közeg jellegétől függetlenül — /?i-globülin elektroforetikus mozgékonyságának megfelélő mozgékonyságú fehérjét tartalmaz. B. lépés: Elektromos koncentrálás. Ha konyhasó-oldatot szabad elektroforézisnek vetünk alá, a két elektródát körülvevő közeg pH-értéke közötti különbség egyre fokozódik. Ha a fenti közegbe nagymértékben hasonló izoelektromos ponttal rendelkező amfoter anyagok élegyét helyezzük, az egyes anyagok — a pH-pradiens kialakulásának megfelelően ^- elválnak egymástól, és különböző szintekben helyezkednek el. Ha a rendszeren megfelelően hosszú ideig bocsátunk át elektromos áramot, az egyes fehérjék ä kialakuló pH-gradiens mentén az izoelektromos pontjuknak megfelelő pH-értéknél halmozódnak fel. A fenti művelétben felhasznált amfoter vegyületek —CH2 —N-(CH 2 )„—N—(CH 2 )p—N— I I I R (CH2 ) m R I NR2 általános képletű, több amino- és karboxil-csoportot tartalmazó, 1000-nél kisebb molekulasúlyú alifás savak — a képletben R jelentése hidrogénatom vagy —(CH2)„—COOH általános képletű csoport, míg m, n és p 5-nél kisebb egész számot jelent. A fenti általános képletnek megfelelő vegyületeket az L. K. B. Produkter A. B. cég, Stockholm, Svédország „Ampholin" néven hozza forgalomba. E vegyületek felhasználásával különböző pH-gradiénsek alakíthatók ki. A fehérjék felhalmozódási helyének rögzítése és az örvényáramok kiküszöbölése érdekében a pH-gradiens mentén végbemenő elektromos koncentrálást sűrűséggradiens fenntartásával kell 5 végezniJ Az izoélektromos elválasztást 110 ml térfogatú LKB 8101 oszlopon vagy 440 ml térfogatú LKB 8102 oszlopon Végezzük. A két koncentrikus henger között elhelyezkedő migrációs kam-10 ra hőmérsékletét vízáramoltatással állandó értéken (+15 C°-on) tartjuk. A platinaelektródokat úgy helyezzük el, hogy az azokon fejlődő gáz ne zavarja a fehérjék koncentrálását. Az amfolinok anódos oxidációjának, illetve katódos redukció-15 jának megakadályozása érdekében az elektródokat híg sav-, illetve híg lúgoldattal választjuk el az amf olinoktól. Az elektródok polaritását a kialakítandó zónának megfelelően választjuk meg. Az oldat veze-20 tőképessége a szacharózkoncentráció függvényében Változik; a vezetőképesség á szacharózkoncentráció növekedésével csökken. Az oldat az elektromos áramot a 6 és 8 közötti pH-tartományban gyengén vezeti. 25 Megfelelő pufferhatás biztosítása érdekében az amfolinökat legalább 1%-os koncentrációban kell alkalmaznunk. Az amfolinok koncentrációjának növelésével biztosíthatjuk az izoélektro-30 mos pontjukon kicsapódásra hajlamos fehérjék szolubilizálását. Az elektromos koncentráláshoz a következő összetételű oldatokat használjuk fel: 35 Nagy sűrűségű oldat: 40°/o-os amfolin-oldat (pH = 3—5) 15 ml Szacharóz 100 g Desztillált Víz q. s. ad 150 ml 40 Kis sűrűségű oldat: 4%-os amfolin-oldat (pH=3—5) 15 ml Desztillált víz q. s. ad 215 ml A nagy illetve kis sűrűségű oldatokat kémcső-45 sorozatban megfelelő arányban elegyítjük egymással. A minta bemérését úgy végezzük, hogy meghatározott mennyiségű kis sűrűségű oldatot azonos mennyiségű, az A. lépésben elkülönített hatóanyagfrakciót tartalmazó oldattal helyette-50 sítünk. Az utóbbi oldat előállítása során 20—100 mg, az A. lépésben elkülönített hatóanyagfrakciót megfelelő mennyiségű kis sűrűségű oldószerben oldjuk. A készülékbe betöltjük az anód-oldatot, majd 55 a megfelelő sűrűség-gradiens biztosítása érdekében az anód-oldat fölé előre elkészített, csökkenő sűrűségű oldatrétegeket rétegezünk. A katódot híg nátriumhidroxil-oldattal választjuk el az amfolin-oIdattóL 60 Az elektródok között 700 V feszültségkülönbséget biztosítunk, ügyelve arra, hogy ä teljesítmény a 8101 típusú készülék esetén ne haladja meg a 2—3 W értéket, illetve a 8102 típusú készülék esetén a 4—6 W értéket. A műveletet 65 48—72 órán át végezzük, ezt az időtartamot 4
