164233. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bisz-ő-2 (tetrazol-5-IL)-4-oxo-benzopiranil-oxi] származékok előállítására
1642; 11 mossuk és szárítjuk, sárga por alakjában 1,8 rész l,3-bisz-[2-(tetrazol-5-Ü-oxi)-4-oxo-4H-l-benzopirán-5-il]-2-klór-propán dinátriumsót kapunk. Igazolás spektrummal 5 Az IV-spektrum (nujol) 1655 cm_1 -nél a benzopirán-gyűrű karbonilcsoportjával összefüggésben csúcsot tartalmaz. 3. példa: l,3-bisz-[2-(tetrazol-5-ií-oxi)-4-oxo-4H-l-benzopirán-5-il]-2-hidroxi-propán 15 0,52 rész l,3-bisz-[2-(tetrazol-5-fl-oxi)-2,3-dihidro-4-oxo-4H-1 -benzopirán-5-il]-2-hidroxi-propán és 0,88 rész szeléndioxidot 10 rész N,N-dimetilformamidban oldunk és az oldatot kevertetés közben 3 20 órán át 85-90 C°-on tartjuk. Lehűlés után a reakcióelegyet szűrjük, és a szűrletet vízbe öntjük. Az így képződött szuszpenziót szűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. Sárga szilárd anyag alakjában 1,3 - b i sz-[ 2-(tetrazol- 5-il-oxi)-4-oxo-4H-1 -benzopirán- 25 -5-il]-2-hidroxi-propánt kapunk, olvadáspont 300 C° (boml.). Hozam: 0,24 rész (47%). A. példa: 30 A következőkben részletezett eljárást arra használhatjuk, hogy kimutassuk egy vegyület hatékonyságát az anafilaxis farmakológiai mediátorai felszabadulásának gátlásában. Ebben a próbában a vegyületeknek a passzív 35 kután anafilaxiás reakció gátlásában való hatékonyságát mutatjuk ki patkányokban. Igazoltuk, hogy ez a vizsgálati forma megbízható kvalitatív jelzést ad a vizsgált vegyületek azon képességére vonatkozóan, hogy gátolják a vegyületek antitest-antigén 40 reakció gátlására irányuló képességét emberben. E kísérleti módszer szerint a Charles River France [Fisons törzshöz tartozó, 100—150 g testsúlyú patkányokat (hím- vagy nőneműeket) fertőztünk szubkután hetenkénti intervallumokban 45 N. brasiliensis larvae-val körülbelül 2000 lárva] állat—12 000 lárva/állat intervallumban növekvő dózisban a fertőzés létrehozására. Nyolc hét múlva a patkányokból szívpunktúrával vért vettünk és mindegyik állatból 15-20 ml vért fogtunk fel. A 50 vérmintákat ezután 30 percen át 3500 ford./perc sebességgel centrifugáltuk annak érdekében, hogy a vérsejteket eltávolítsuk a vérplazmából. A szérumot összegyűjtöttük és arra használtuk fel, hogy N. brasiliensis antitestet tartalmazó szérumot állítsunk 55 elő. Kísérleti érzékenységi próbát végeztünk annak meghatározására, hogy mekkora az ahhoz szükséges legkisebb szérum-mennyiség, hogy a kontroll állatokban a leírt vizsgálat szerint 2 cm-nél kisebb átmérőjű bőrcsíkot kapjunk. Azt találtuk, hogy a 60 100-130 g testsúly-tartományban a patkányok optimális érzékenységét úgy érjük el, hogy 8 rész fiziológiás sóoldattal hígított szérumot használunk. Ezt a hígított oldatot, A antitest-szérumnak nevezzük. 65 Az A-szérumban levő antitesttel való reakcióhoz az antigént úgy állítjuk elő, hogy a fertőzött patkányok beléből eltávolítjuk a N. brasiliensis férgeket, a homogenizátumot centrifugáljuk és a felületúszó folyadékot összegyűjtjük. Ezt a folyadékot sóoldattal hígítjuk 1 mg/ml protein-tartalomra: ezt az oldatot B. oldatnak nevezzük. A 100-130 g testsúly-tartományban Charles River France/Fisons fajtához tartozó patkányokat szenzibilizáltunk oly módon, hogy jobb oldalukba iníradermálisan 0,1 ml A szérumot injektáltunk. 24 órán át hagytuk kialakulni az érzékenységet, majd a patkányokba intravénásán 1 ml/100 g testsúly dózissal intravénásán 0,25 ml B oldat, 0,25 ml Evans kék festékoldat és 0,5 ml, az aktív anyagot változó százalékos mennyiségben tartalmazó vizsgálandó vegyület-oldat keverékét injektáltuk. Az oldhatatlan vegyületeket külön intraperitoneálisan injekció alakjában adjuk be 5 perccel a B oldat és az Evans kék festék intravénás bevitele előtt. A vizsgálandó oldat aktív anyag-tartalma mindegyik százalékos szintjére öt-öt patkányt injektáltunk. Mindegyik kísérletben öt patkányt használtunk kontrollként. A vizsgálandó vegyület dózisait úgy választottuk meg, hogy az a gátló értékek tartományát szolgáltassa. A B oldat injektálása után 30 perccel megöltük a patkányokat, a bőrt eltávolítottuk és kifordítottuk. Az anafilaxiás reakció intenzitását úgy állapítottuk meg, hogy a jellegzetes kék csík nagyságát — amely annak következtében képződött, hogy a szenzibilizálás helyéről szétdiffundált az Evans kék festék - összehasonlítottuk a kontroll állatokban jelentkező csík nagyságával. A csík nagyságát 0-4 között osztályoztuk (nem figyelhető meg csík, azaz 100%-os gátlás, illetve nincs különbség a csík nagyságában, azaz nincs gátlás) és az egyes dózis-szintekre a százalékos gátlást a következőképpen számítottuk ki: (a kontroll csoport pontszáma — a kezelt csoport pontszáma) X 100 gátlás, % = a kontroll csoport pontszáma A különböző dózis-szintekre a százalékos gátlást mindegyik vegyületre grafikusan vittük fel. Ezekből a grafikonokból meghatározható az anafilaxiás reakció 50%-os gátlása elérésének szükséges dózis (LDS0 ). A vegyületeket a fenti módon úgy is értékeltük, hogy a vegyületet bélbe és gyomorba vittük be. B. példa: Egy inhalációs készítmény 20 mg I általános képletű vegyület, például l,3-bisz-[2-(tetrazol-5-il)-4-oxo- 4H -1 -benzopirán-5-il-oxi]-2-hidroxi-propán dinátriumsó — tényleges részecskenagyság 1-10 mikron — és 20 mg 32—63 mikron tényleges részecskenagyságú kristályos laktóz keverékét tartalmazza. A készítmény zselatin kapszulába helyezhető. 6
