164195. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új S-232 antibiotikum előállítására
164195 3 4 Találmányunk alapja az a felismerés, hogy az általunk a Szabolcs-Szatmár megyei Mérk községben kotus talajból izolált Streptomyces sp S—-232 (00069 OKI szám alatt deponált törzs) előnyösen alkalmazható az S—232 antifungális anyag ipari előállítására. A Streptomyces sp. S—232 (00069 OKI szám alatt deponált törzs) morfológiai és fiziológiai tulajdonságai az alábbiak: A szubsztrátimicélium nem darabolódik, benne chlamidospőrák nem figyelhetők meg. A légmícéliurnban a spóratartők 1—3 kanyarulata, általában primitív spirálok. Élesztők! vonat-malátakivonat-agaron erőteljesen fejlett, vörös (cinnamomeus) színű, porszerű légmieélium. Színtelen szubsztrátmicélíum, oldódó pigment nincs. Glicerin-aszparagin-agaron gyenge növekedés, színtelen szubsztrátmicélium, feihér, sterilis légmieélium. A közeg nem színeződik. Vas-pepton^agaroin erőteljesen fejlett, színtelen szubsztrátmicélium, gyengén fejlett, szürke porszerű légmieélium, világos sárga oldódó pigment. Melanoid pigmentet neim termel. Keményítő-hidrolízis intenzív. Proteolitikus aktivitás egyidejűleg adott anorganikus N-forrás jelenlétében nem mutatható ki. Az anorganikus N-vegyület felhasználása után pozitív. Bakteriolitikus aktivitást fejt ki a tápagarban szuszpendált, hővel elölt Staphylococcus albus sejtjeire. A cellulózt egyedüli szénforrásként értékesíti, 3 hét után erőteljesen bontja. Lipolitikus aktivitása: nem nagy intenzitással, de képes a Tween 80 bontására. Chroimogenitási próba negatív. Az antibiotikus aktivitást kémiai és biológiai módszerrel párhuzamosan határoztuk meg. A kémiai módszer az antibiotikum UV spektrumának abszorpciós maximum (338 mu) és abszorpciós minimum (330 mu. 350 ma) hullámhossz extinkciómérésen alapszik, a hatóanyagtartalom kiszámítás kalibrációs görbe segítségével történik. A fermentlé antibiotikum tartalmát analitikai tisztaságú metilalkohollal extraháltuk és a jellemző hullámhossz értékeknél az extinkciókat meghatároztuk metilalkohol vakpróbával szemben. Az előállított antibiotikum hatóanyagtartalmát hasonlóan határoztuk meg. Kalibrációs görbét az előállított kristályos antibiotikumból készítettük el. Az antibiotikum biológiai hatóanyagtartalmát agardiffúziós eljárással határoztuk meg élesztőgombákkal szemben. Az anyag előkészítése a kémiai módszernél leírtakkal megegyező volt. Eljárásunkat az alábbi kiviteli példán szemléltetjük: A Streptomyces sp. S—232 {00069 OKI szám alatt deponált) törzsből oltóanyag készítés céljából szilárd táptalajon 1 literes Roux-palackban 28 C°-on 5—6 napig történő inkubálással spórás tenyészetet állítottunk elő, A spórás tenyészetből 105 db/ml spórát tartalmazó vizes szuszpenziót készítettünk. Az előállított oltó-spóraszuszpenziót inokulum fermentáció készítése céljából 1200 1 táptalajba oltottuk, mely táptalajnak az összetétele a következő volt: szójaliszt 1%, borsóliszt 1%, ku-5 korícalekvár (100%-os) 1,5%, kazein hidrolizátum 0,5%, glükóz, 3,5%, élesztőkivonat 0,1%, CaCo3 0,7%. A tenyésztést 1,5 szulfít értéket eredményező 10 kevertetés mellett (60 m3 /óra steril levegő bekeverésével) 28 C°-on 42 órán át végeztük. Az előállított inokulum fermentációból 10%nyi mennyiséggel oltottuk be fermentáció készítése céljából a következő összetételű 1200 1 15 steril táptalajt: szójaliszt 1%, borsóliszt 1%, kukoricalekvár (100%-os) 1,5%, kazein hídrolizátum 0,5%, glükóz 3,5%, élesztőkivonat 0,1%, CaCO:! 0,7%. A tenyésztést 2,0 szulfit értéket eredményező 20 kevertetés mellett (60 m3 /óra steril levegő bekeverésével) 28 C°-on 114 órán át. végeztük. Az előállított fermentléből a hatóanyagot ismert módon (156.574 Isz. magyar szabadalmi le-25 írás: Eljárás a G—252 antibiotikum előállítására és kinyerésére) a micéliumra csaptuk ki. A micéliuamot másfélszeres mennyiségű aoetonnal felszuszpendálva a hatóanyagot extraháltuk. Vákuumban 35 C°-on acetonimentesre párolva 30 a nyerstermék kivált, A nyersterméket ioncserélt vízzel addig mostuk, míg a mosófolyadék színeződést nem 'mutatott. Tisztítás: 35 A nyersterméket ötszörös mennyiségű metanollal extraháltuk 50 C°-on. Az oldhatatlan maradéktól megszűrve hidegen kristályosítottuk, majd petroléter és 'aceton 3 : 1 keverékével át-40 mostuk. Vákuumban szobahőmérsékleten szárítottuk. A kinyert hatóanyag jellemző tulajdonságai a következők: sárgás-barna színű kristályos anyag, olvadáspontja 195—305 C°. Oldódik dí-45 metilszulfoxidban, 5% CaÖ2-t tartalmazó metanolban, 10% víztartalmú etanolban, közepesen oldódik butilalkoholban, etilacetátban, nem oldódik vízben. A 700—4000 cm"1 hullámszámon felvitt infra-50 vörös abszorpciós spektruma jellemző rezgései alapján, valamint UV spektruma maximumai (323, 338 és 356 ina) alapján az anyag a pentaének közé sorolható. Az így kinyert hatóanyag az általunk vizs-55 galt Alternaria tenuis, Botrytis allii, Botrytis cinerea, Fusarium eulmorum, Helminthosporium sp., Trichotecium roseum, Verticillium albo-atrum, Nigrosp'ora oryzae, Penicillium roqueforti, Aspergillus flavus gombafajok növekedését gá-60 tolta in vitro 10 gamma/ml koncentrációban. Az élesztők közül a Candida albicans növekedését 3,75 gamma/ml, a Candida tropicalis növekedését 4,37 gamma/ml, a Saccharomyces cerevisiae növekedését 3,13 gamma/ml koncentrá-65 oióban gátolta. 2
