164156. lajstromszámú szabadalom • Eljárás YA-56 antibiotikum előállítására

17 164156 18 tenyésztést 25-30 C°-on, 670-800 l/perc sebességű levegőztetés és 225 fordulat/perc sebességű keverés közben végezzük, és a fermentorban uralkodó nyomást 0,5 kg/cm2 értéken tartjuk. A kapott fermentlé teljes aktivitása Escherichia coli 5 vizsgálati mikroorganizmussal szemben 1550X 103 meg, Bacillus subtilis vizsgálati mikroorganizmussal szemben 285 X103 meg. 2. példa Az YA 56 antibiotikum rézkelátjának kivonása és elkülönítése 15 Az 1. példában kapott fermentlé pH-ját 6,8-ra állítjuk, és a fermentlevet diatómaföld szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. A szilárd anyagokat vízzel mossuk, és a szűrletet egyesítjük a mosófolyadékkal. Az oldatot 28 X 200 cm méretű 20 rozsdamentes acélcsőbe töltött 20 liter porózus mátrix-gyanta oszlopon (Duolite S—30, a Diamond Shamrock Chemical Company cég terméke) bocsátjuk át. A gyanta megköti a hatóanyagot. Az oldat áthaladása után az oszlopot 25 200 liter vízzel és 50 liter 80%-os vizes acetonnal mossuk, majd az oszlopot 100 liter 2:8 arányú 0,1 n sósavoldat - aceton eleggyel eluáljuk. Az eluátumot 5 n vizes nátriumhidroxid-oldattal pH = 6,5-6,8 értékre lugosítjuk, majd csökkentett 3Q nyomáson betöményítjük, és a kapott koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 210 g nyers YÁ 56 antibiotikumot (rézkelát, hidroklorid) kapunk barna por formájában. 35 210 g nyers antibiotikumot 3 X 0,5 liter metanollal extrahálunk. A metanolos oldatokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson 0,8 liter végtérfogatra bepároljuk. A koncentrátumhoz 9 liter acetont adunk, és a kivált poralakú terméket 40 leszűrjük. A kapott 55 g terméket 100 ml vízben oldjuk, és az oldatot 7,5 g aluminiumoxiddal töltött 8 X 200 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot vízzel eluáljuk, és az eluátumot frakciókba gyűjtjük. Az 1. frakció térfogata 45 250 ml a 2. frakció térfogata 1320 ml, míg a 3. frakció térfogata 10730 ml. Az antibiotikum főtömegét a 2. frakció tartalmazza. A 2. frakció pH-ját 1 n sósavoldattal 6,5-6,8 értékre állítjuk, 50 majd a frakciót fagyasztva szárítjuk. A kapott kékes-zöld port 125 ml metanollal extraháljuk, és a metanolos oldatot csökkentett nyomáson 50 ml végtérfogatra bepároljuk. A koncentrátumot alkilezett keresztkötésű dextrángéllel (Sephadex 55 LH—20, a Pharmacia Fine Chemical Co. cég terméke) töltött, 5 X 135 cm méretű oszlopon bocsátjuk át, és az oszlopot metanollal eluáljuk. Az eluátumot frakciókba gyűjtjük. Az első frakció (a továbbiakban: 4 frakció) térfogata 60 550 ml, a második frakció (a továbbiakban: 5. frakció) térfogata 250 ml, míg a harmadik frakció (a továbbiakban: 6. frakció) térfogata 1670 ml. Az antibiotikum főtömegét az 5. frakció tartalmazza. Ezt a frakciót csökkentett nyomáson 65 95 ml végtérfogatra bepároljuk, majd a koncentrátumhoz fölöslegben vett acetont adunk. A kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük, és szárítjuk A kapott 1,5 g kék színű port alkilezett keresztkötésű dextrángéllel (Sephadex LH-20, a Pharmacia Fine Chemical Co. cég terméke) töltött oszlopon újra kromatografáljuk, oldószerként metanolt használunk. 70 ml, így kapott eluátumot csökkentett nyomáson 30 ml végtérfogatra betöményítjük, és a koncentrátumhoz fölöslegben vett acetont adunk. A kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük. 500 mg YA 56 antibiotikumot (rézkelát, hidroklorid) kapun k kék színű por alakjában. A poralakú termék aktivitas'1 Escherichia coli viszgálati mikroorganizmussal szemben 877 meg/mg, Bacillus subtilis vizsgálati mikroorganizmussal szemben 239 meg/mg. A fenti eljárás során kapott 1., 3., 4. és 6. frakcióka egyesítjük, majd a kapott oldatot egymás után alumíniumoxid-oszlopon, keresztkötéses dextrángél-oszlopon (Sephadex G-l 5, a Pharmacia Fine Chemical Co. cég gyártmánya) és alkilezett keresztkötéses dextrángél-oszlopon (Sephadex LH-20, a Pharmacia Fine Chemical Co. cég gyártmánya) bocsátjuk át. A kapott eluátumot a fent ismertetett módon dolgozzuk fel. 370 mg YA 56 antibiotikumot (rézkelát, hidroklorid) kapunk. A kapott antibiotikum aktivitása Escherichia coli vizsgálati mikroorganizmussal szemben 1000 meg/mg, Bacillus subtilis vizsgálati mikroorganizmussal szemben 65,3 meg/mg. 3. példa Az YA 56 antibiotikum elkülönítése és tisztítása 800 mg, a 2. példában kapott YA 56 antibiotikumot (rézkelát, hidroklorid) 55 ml abszolút metanolban oldunk, és az oldatba 4-5 percen át szobahőmérsékleten száraz hidrogénszulfid-gázt vezetünk. A kivált barna csapadékot centrifugálással elkülönítjük. A halványsárga szűrletből csökkentett nyomáson eltávolítjuk a metanolt, és a kapott maradékot vákuumban szárítjuk addig, amíg a kénhidrogén szaga már nem érezhető. A száraz maradékot 25 ml metanolban oldjuk, és az oldathoz hétszeres térfogatú acetont adunk. A kivált fehér csapadékot centrifugálással elkülönítjük, acetonnal mossuk, és szárítjuk. A kapott 0,7 g fehér port 15 ml metanolban oldjuk, és a metanolos oldatot alkilezett keresztkötésű dextrángéllel (Sephadex LH-20, a Pharmacia Fine Chemical Co. cég terméke) töltött 5X 135 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot metanollal eluáljuk, és a biológiai aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük. A kapott 370 ml térfogatú oldatot csökkentett nyomáson 20 ml végtérfogatra bepároljuk, és a koncentrátumhoz 150 ml acetont adunk. A kivált fehér csapadékot centrifugálással elkülönítjük, és szárítjuk. 580 mg fehér, poralakú YA 56 antibiotikumot kapunk hidrokloridja alakjában. 9