164116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációs úton nyert nyers peptid-alkaloidbázisok tisztítására

5 Oldószer a) % Etilalkohol 22 Aceton 20 Metilizobutilketon 20 Etilacetát 20 Kloroform 16 Széntetraklorid 10 A továbbiakban ezért különböző Claviceps purpurea törzsek peptid-alkaloid tartalmú szaprofita tenyészeteit a fenti oldószerekkel extraháltuk, az extraktumból lepárlással vagy szénhidrogénekkel történő kicsapással nyers alkoloid bázist nyertünk és részletesen vizsgáltuk az így nyert termék tisztithatóságát. Meglepő módon azt találtuk, hogy ha az így nyert bármely nyers peptid-alkaloid bázist vízzel elegyedő és korlátoltan elegyedő oldószerpárban feloldottuk és Brockmann II. aktivitású alummíniumoxid oszlopon azonos oldószerpárral kromatografáltuk, úgy az adszorbens szelektíven a ballasztanyagok nagy részét - „a" és „b" frakciókat-megkötötte, mig az alkaloidok a ballasztanyagok kisebb hányadával - „c" és „d" frakciók — az aluátumban maradtak. Ezután a peptid alkaloidokat tartalmazó eluátumot savanyú víz hozzáadásával két fázisra bontottuk, mikoris az apoláros fázis csak a ballasztanyagok „c" frakcióját, a poláros fázis pedig az alkaloidokat és a maradék „d" ballasztanyag frakciót tartalmazta. Végül tiszta alkaloid oldathoz oly módon jutottunk, hogy a kétkomponensű poláros fázist apoláros oldószer hozzáadásával ismét két fázisra bontottuk: ez esetben a vízzel nem elegyedő fázisban a ballasztanyagok, a vizes fázisban pedig a tiszta peptid-alkaloid sók egymástól elváltak. A találmány tárgya eljárás Claviceps purpurea szaprofita tenyészetek oldószeres extraktumaiból bepárlással, vagy szénhidrogénekkel történő kicsapással nyert nyers peptid-alkaloidbázisok tisztítására, azzal jellemezve, hogy a peptid-alkaloidokat tartalmazó nyersterméket vízzel elegyedő és vízzel korlátoltan elegyedő komponensből álló szerves oldószerpárban oldjuk, az oldatot abszorpciós kromatografálással tisztítjuk, az eluciót azonos oldószerpárral végezve a peptid-alkaloidot tartalmazó eluátumot híg vizes savoldat hozzáadásával két fázisra bontjuk, majd a peptid-alkaloidok sóit oldva tartalmazó nagyobb fajsúlyú fázisból szénhidrogén vagy szénhidrogének hozzáadásával a savanyú vizet kiszorítjuk, a szennyezés mentes peptid-alkaloidok sóit tartalmazó vizes fázisból a kapott peptid-alkaloid sókat, adott esetben a vizes fázis meglúgosításával kapott peptíd-alkaloidbázisokat ismert módon kinyerjük, kívánt esetben a kapott peptid-alkaloidbázisokat más sóvá alakítjuk. A találmány szerint oly módon járunk el, hogy a Claviceps purpurea tenyészet extraktumából nyert anyarozs peptid-alkaloidot(okat) tartalmazó nyers alkaloid bázist mintegy tízszeres térfogatmennyiségű vízzel elegyedő alkohol, vagy keton — előnyösen izopropanol, vagy aceton — és vízzel 164116 Ballasztanyag frakció Peptidb) c) d) alkalc % % % % 20 27 ' 14 17 22 26 16 16 23 25 16 16 20 25 16 16 18 28 20 18 18 35 20 17 korlátoltan elegyedő karbonsavészter — előnyösen etilacetát - 6:4 - 4:6 arányú elegyében enyhe 15 melegítés közben feloldjuk. Az oldatot a feloldott nyers alkaloidbázis súlyának 8—10-szeres mennyiségű aktív alumíniumoxid adszorbenst tartalmazó oszlopra öntjük fel. Az adszorbens oszlop magasság-átmérő aránya optimálisan 4:1. Az 20 adszorbens eluálását a fenti oldószerpárral végezzük, míg az eluátum színe vörösből sárga színbe megy át és van Urk reakcióval vizsgálva alkaloidot már nem tartalmaz. Az eluátumhoz ezután annyi vizes savoldatot adunk, mig a terner elegy két 25 fázisra válik széjjel. Az alkaloidot(okat) tartalmazó nagyobb fajsúlyú fázisból szénhidrogént, vagy szénhidrogének — előnyösen petroléter — hozzáadásával a vizet kiszorítjuk. A tiszta alkaloid sót(sókat) tartalmazó vizes fázist elválasztjuk, majd 30 pH 8 értékre történő lúgosítás után benzollal extraháljuk. A benzolos extraktum bepárlása révén a peptid-alkaloid bázis kristályosodik. A találmány szerinti eljárást az alábbi példák szemléltetik: 1. példa: Claviceps purpurea OKI 00022 sz. törzsek 40 szacharózt, glicint és anorganikus sókat tartalmazó táptalajon, pH 5,6 értéken saválló fermentorban kevertetve és levegőztetve 8 napig inkubálunk. A 8. napon a tenyészet 1100 7/ml ergotoxint tartalmaz, melynek összetétele: ergokriptin 30%, 45 ergokornin 65%, ergokrisztin 5%. 2001 tenyészetet 80 kg ammóniumszulfát hozzáadása után pH 7 értéken 100 liter acetonnal extraháljuk. Az extraktum pH értékét foszforsawal 3,5-re állítjuk, majd vákuumbepárlón oldószermentesre sűrítjük. A 50 visszamaradó kb. 18 liter térfogatú savas-vizes sűrítményt a peptid alkaloidok kivonása céljából 2x3 liter kloroformmal extraháljuk, az egyesített kloroformos extraktumot nátriumszulfáttal szárítjuk, majd vákuumbepárlón 2 literre sűrítjük. A 55 kloroformos sűrítményt állandó keverés közben 20 liter petroléterhez öntjük, a kivált nyers alkaloid bázist szűrjük, megszárítjuk. A szárazanyag súlya 1050 g: ezt a taálmány szerint eljárva 10,5 liter aceton és etilacetát 1:1 arányú elegyében 60 enyhe melegítés közben feloldjuk, majd az oldatot előre elkészített Brockmann II. aktivitású alumíniumoxid oszlopra öntjük fel. Az adszorbens oszlop magasság-átmérő aránya 4:1, a töltet mennyisége az oldott anyag súlyának 8-1-szerese. 65 Az adszorbens elucióját fenti aceton és etilacetát