164094. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az EM-49 antibiotikum és összetevői előállítására
3 164094 4 Az EM-49 antibiotikum és összetevői gombák és Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok, például Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa és Candida albicans ellen hatásosak. Ezért az antibiotikumot vagy ennek fiziológiailag elviselhető sóját mikrobák ellen környezeti fertőtlenítőszerként, például szokásos vívőanyágban körülbelül 1% hatóanyagot tartalmazó permetként vagy porként használhatjuk, vagy különféle állatoknak a felsorolt mikroorganizmusok okozta fertőzései leküzdésére, például helyileg, körülbelül 1% hatóanyagot tartalmazó krém vagy kenőcs alakjában vagy napi 50-125 mg/kg-os injekciós adag alakjában alkalmazhatjuk. Egerekben például a halálos Escherichia coli fertőzés elleni EDS 0 adag körülbelül 50 mg/kg. A mikroorganizmus Az EM—49 antibiotikum előállítására használt mikroorganizmus egy talajból izolált Bacillus circulans törzs. A mikroorganizmus tenyészete beszerezhető az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland állandó törzsgyűjteményéből. Sorszáma a gyűjteményben ATCC 21656. A Bacillus circulans ATCC 21656 jellemzői a következők: Mikroszkopikusan: spóraképző bacillus, és Gram-festődése változótól Gram-negatívig terjedhet. A spórák centrikusak vagy szubcentrikusak, oválisak: a spórafal vastag és könnyen festődik: a sporangium határozottan duzzadt. A pálcikák nem alkotnak láncokat. A 0,5%-os bázisos fukszinnal festett kenetek gyenge tokosodást mutatnak. Makroszkopikusan: glukóz-agar táptalajon a telepek fényesek, szélük sima vagy karéjos. A telepek tapadósak, nagyon nyálkásak: mozgékonyak, az agar felületén gyorsan szétszélednek, különösen akkor, ha a Petri-csésze nedves. Folyékony táptalajban a tenyészet meglehetősen zavaros, és sűrű üledéket képez. Vastag nyálkás hártya képződik, és a folyékony tenyészetet a szó szoros értelmében lezárja. Fiziológiai jellemzők: az acetilmetilkarbinol-képződés megállapítására használt Voges-Proskauer-próba negatív. Az indolképzési próba negatív. A keményítőt és kazeint a mikroorganizmus erősen hidrolizálja. Szénhidrátokból nem fejleszt gázt, de egyedüli szénforrásként glukózt, szacharózt vagy xilózt tartalmazó szervetlen táptalajon növekszik, és savat képez. 60—65 C°-on a növekedés megszűnik. Az antibiotikum termelése A Bacillus circulans ATCC 21656 a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben a Candida albicans és hasonló gombákkal szemben hatásos antibiotikumot termel. Az antibiotikum előnyös előállítási módja szerint a Bacillus circulans ATCC 21656-ot asszimilálható szénhidrátot és nitrogénforrást tartalmazó vizes táptalajban, sülylyesztve, aerob körülmények között körülbelül 25C°-on tenyésztjük. A fermentálást 60-150 óra hosszat, előnyösen körülbelül 144 óra hosszat folytatjuk. Ennek az időtartamnak végén az antibiotikum kialakítása megtörtént. A fermentálás befejezése után a fermentlé 5 pH-ját savval, például tömény sósavval 2-re állítjuk be. A megsavanyított fermentléhez szűrést elősegítő anyagot adunk, és az egész szuszpenziót szűrőre visszük. A szűrőn maradó anyagot vízzel bőségesen mossuk, és a mosóvizeket a szűredékkel egyesítjük. 10 A mosott szfirőlepényt eldobjuk. Az egyesített szűredéket és mosóvizet vízzel telitett n-butanollal extraháljuk. A butanolos kivonatot vákuumban 45 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten kis térfogatra bepároljuk, majd térfogata 15-szörösének megfelelő IS acetont adunk hozzá. A kivált csapadékot acetonnal, etilacetáttal és éterrel mossuk, és szárítása után világos sárgásbarna port kapunk. Az antibiotikumot ebben a nyers termékben n-propanol, n-butanol, víz és ecetsav 50:75:100:2 20 térfogatarányú rendszerét használva ellenáramú megoszlással tovább tisztítjuk. A 29 átviteles ellenáramú megoszlással kapott anyagot az antibiotikum jellemzésére használjuk. Az EM-49 antibiotikum bázisos peptid, és 25 különféle savakkal sókat alkot. Mivel az előnyös eljárás a fermentlé savval való megsavanyításából áll, az antibiotikumot sóként kapjuk. Ha a fermentlevet sósavval savanyítjuk meg, hidrokloridot kapunk. Egyéb ásványi savakat, például 30 hidrogénbromidot, kénsavat stb. használva, a megfelelő sav sóját kapjuk. Az antibiotikumnak sóként kapott alakját a bázis felszabadítására lúggal, például nátriumhidroxiddal közömbösítjük, és kívánság esetén ezt a bázist más sav sójává 35 alakíthatjuk azáltal, hogy ecetsavat, propionsavat vagy egyéb szerves savat vagy foszforsavat adunk hozzá. A vízben oldhatatlan sók, például az arilszulfonsavak, mint a 2-naftalinszulfonsav, metiloranzs, p-fenilazobenzolszulfonsav stb. sói úgy 40 állíthatók elő, hogy az EM-49 sót, például hidrokloridot az arilszulfonsav alkálifémsójával reagáltatjuk. Az EM—49 antibiotikum elkülönítésének különösen előnyös módja a heliantát előállítása. A 45 bepárolt anyagból a fent említett módon kicsapással kapott világos sárgásbarna porhoz metiloranzs vizes oldatát adjuk, mire az EM-49 heliantátja kicsapódik. Ekkor a heliantát amorf, és dimetilformamidból vagy metanol és acetonitril elegyéből 50 való ismételt kicsapással tisztítható. A heliantátot sósavval reagáltatva újra hidrokloriddá alakíthatjuk. A fent említett világos sárgásbarna, acetonban oldhatatlan por tartalmazza az EM—49 antibiotikumot. Ez az anyag a fent leírt módon tisztítható, és 55 tisztított alakban használható. A tisztított por közeli rokon peptid antibiotikumokat tartalmaz, ezeket például ioncserélő kromatografálással lehet egymástól elválasztani. Mindegyikre jellemző, hogy négy szabad aminosavcsoportot tartalmaz. 60 A fent leírt módon heliantáton át előállított EM-49-hidrokloridot vizes oldatban karboximetilcellulóz-nátriumot tartalmazó oszlopon kromatografáljuk, és híg nátriumklorid oldattal eluáljuk: az antibiotikum így az eluátum felületi feszültsége 65 „által jelzett négy frakcióra válik szét. Ezeknek a 2
