163897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amfotericin B tisztítására
3 163897 4 A kiindulási nyers amfotericin B-t dimetilformamidban oldjuk. Célszerűen a nyers amfotericin B dimetilformamidos szuszpenzióját készítjük el, oly módon, hogy 1 súlyrész nyers amfotericin B-t 10-20 térfogatrész dimetilformamiddal keverünk és a keverék pH-értékét keverés közben tömény sósavval 7—7,5-re beállítjuk. A keveréket ezután a heptének teljes oldódásáig még 1,5—2 órán át keverjük, majd a dimetilformam d térfogatára számítva, keverés közben lassan 0,5 térfogat desztillált vizet adunk hozzá. Ezt követően a keverék pH-értékét 10%-os sósavval 2,0-3,6-ra beállítjuk és a kivált csapadékot — ami lényegileg inaktív hepténből áll - szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk és eldobjuk. A tiszta oldathoz keverés közben 1 térfogat desztillált vizet adunk (a DMF térfogatára számítva). Ezután a keverék pH-értékét 10%-os nátriumhidroxid-oldattal 6,5-7,0rra beállítjuk és az antibiotikum így kapott szuszpenzióját szűrjük vagy centrifugáljuk. A képződött pasztát 50%-os vizes n-propanol-oldattal, majd acetonnal mossuk és vákuumban szárítjuk. Az így kapott amfotericin B fajlagos aktivitása 800-900 jug/mg, és extinkciója: Eicm = 1450-1600, hamutartalma 0,5%-nál kevesebb. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi az amfotericin B-nek injekciók készítésére alkalmas nagy tisztasági fokban való előállítását. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: 25 g nyers amfotericin B-t, amelynek biológiai aktivitása 500/xg/mg, 13, A kiindulási anyagként alkalmazott 500jug/mg aktivitású nyers antibiotikumotextinkciója, E\fm = 1100 és amfotericin A tartalma kisebb, mint 5%, 500 ml dimetilformamiddal 20C°-on keverünk. A keverék pH-értékét keverés közben, tömény sósavval 7,2-re beállítjuk és a keverést még 1,5 órán át folytatjuk. Az így kapott oldathoz lassan, 1 óra alatt, keverés közben 250 ml desztillált vizet adunk. A keverék pH-értékét 10%-os sósav hozzáadásával 3,2-re beállítjuk. A kivált csapadékot vákuumban kiszűrjük és eldobjuk. A tiszta oldathoz keverés közben 500 ml desztillált vizet adunk, a keverék pH-értékét 10%-os vizes nátriumhidroxid-oldattal 6,5-re beállítjuk és a kapott szuszpenziót centrifugáljuk. A paszta alakban jelenlévő antibiotikumot keverés közben 500 ml 50%-os vizes n-propanollal 2 órán át szobahőmérsékleten mossuk. Ezt követően a pasztát centrifugáljuk, acetonnal mossuk, szűrjük és lOtorr nyomáson és 20 C° hőmérsékleten szárítjuk. A késztermék súlya 8,0 g, a por fajlagos biológiai aktivitása 800 Mg/mg, és extinkciója E}^m = 1500. Az amfotericin B kitermelés a nyersanyag aktivitására számítva 51%. A kiindulási anyagként alkalmazott 500 Mg/mg, aktivitású nyers antibiotikumot például az alábbi módon állíthatjuk elő. Az Actinomyces nodosus micéliumát a táptalajtól elkülönítjük és 10-11 pH-értéken kalciumkloridot tartalmazó metanollal vagy vizes izopropanollal extraháljuk. Az extraktumot adott esetben semlegesítjük, majd bepároljuk. A koncentrátumhoz 0,5-2 térfo at vizet adunk, a nyers antibiotikumot 5 elkülönítjük, acetonnal mossuk és szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. Az ily módon előállított nyers antibiotikum specifikus aktivitását kémiai és biológiai úton határozzuk meg. 10 A kémiai úton végzett meghatározás abban áll, hogy 363, 382 és 406 mu-on spektrofotometriásán megmérjük az antibiotikum metanolos oldatának abszorpciós maximumait és a hiteles minta adatai alapján mégha ározzuk az aktivitást. 15 A biológiai úton végzett meghatározást az Amerikai Egyesült Államok gyógyszerkönyve (US Pharmacopoea XVII., 1965.) szerint hajtjuk végre. 2. példa: 100 g nyers amfotericin B-t, amelynek fajlagos biológiai aktivitása 500/ig/mg, extinkciója 25 Ej fm = 1150 és amfotericin A tartalma kisebb, mint 5%, keverővel ellátott zománcozott készülékbe adagolunk, 1 liter dimetilformamidot öntünk hozzá és a keverék pH-értékét keverés közben tömény sósav hozzáadásával 7,0-re beállít-30 juk. Ezt követően a keverést még 2 órán át folytatjuk. Az így kapott oldathoz lassan, 1,5 óra al tt, keverés közben 0,5 liter desztillált vizet adunk, s a keverék pH-értékét tömény sósavval 2,8-ra beállítjuk. A kivált csapadékot centrifugálás-35 sal elkülönítjük és eldobjuk. A zománcozott készülékben levő tiszta oldathoz keverés közben 1 liter desztillált vizet adunk, a keverék pH-értékét 10%-os vizes nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával 6,8-ra beállítjuk és a kivált csapadékot centrifugá-40 lássál elkülönítjük. Az így kapott pasztát zománcozott készülékben 2 liter 50%-os vizes n-propanollal 3 órán át szobahőmérsékleten mossuk. Ezt követően a pasztát centrifugáljuk, acetonnal mossuk, szűrjük és lOtorr nyomáson és 20C° hőmérsék-45 léten szárítjuk. A késztermék súlya 20 g, a por fajlagos biológiai aktivitása 900jug/mg és extinkciója Ej^j, =1500. Az amfotericin kitermelés a nyerstermék aktivitására számítva 36%. 50 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás amfotericin B tisztítására a terméknek a nyers antibiotikum dimetilformamidos oldatából 55 vízzel végzett kicsapásával és szerves oldószerrel végzett mosásával, azzal jellemezve, hogy a nyers antibiotikum dimetilformamidos oldatához, a dimetilformamid térfogatára számítva 0,5 térfogat desztillált vizet adunk, a keverék pH-értékét savval 60 2-3,6-ra beállítjuk, a kivált szennyező anyagokat elkülönítjük, az oldathoz a kiindulási dimetilformamidéval egyenlő mennyiségű vizet adunk, a keverék pH-értékét 6,5-7,0-re beállítjuk, a kivált terméket elkülönítjük, vizes n-propanollal és acetonnal mos-65 suk és szárítjuk. 2
