163894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzim-polimer komplex mosószeradalékok előállítására

5 163894 6 10. reagens: 2,5 ml Tween 80 (polioxietilénszorbitánmonooleát) desztillált vízben oldva, és kiegészítve 50ml-re. 11. reagens: 100 ml 7. reagens, 100 ml 8. reagens, 100 ml 9. reagens és 4 ml 10. reagens ilyen sorrendben összeöntve, és desztillált vízzel 100 ml-re hígítva. 12. reagens: kazeinszubsztrátum-oldat. Ez az oldat a következőképpen készül: 36,0 g kazeint (Merck, biokémiai célokra) keverés közben feloldunk 2,5 liter 4. reagensben. A keverést 10 percig folytatjuk, majd hozzáadunk 300 ml 5. reagenst, és a keveréket még 10 percig keverjük. Ezután vízfürdőn 70°-ra felmelegítjük, miközben a keverést 40 C°-ig folytatjuk. Ezen a hőmérsékleten a pH-t n nátriumhidroxid-oldattal beállítjuk 8,5-re. Szobahőmérsékletre való hűtés után a keverék térfogatát 4. reagenssel 3 literre kiegészítjük, és ismét keverjük. Ez az oldat hűtőszekrényben eltartva 1 napig használható. A proteáz aktivitását a következőképpen határozzuk meg: Egy homogén enzimkészítmény lemért mennyiségét feloldjuk kellő mennyiségű 6. reagensben. Az oldat pH-ját szobahőmérsékleten n nátriumhidroxid-oldat vagy n sósav hozzáadásával beállítjuk 8,5-re. Az oldat enzimtartalmát ugy választjuk meg, hogy az oldat aktivitása 20-30 Delft-egység (DE) legyen milliliterenként. Ez az oldat ne álljon tovább 2 óránál. Az enzimoldatot, a kazeinoldatot és néhány centrifugacsövet vízfürdőn 40±0,1 C°-ra melegítünk. 1 ml enzimoldatot egy centrifugacsőbe pipettázunk. Amikor ennek az oldatnak a hőmérséklete elérte a kívánt 40 C°-ot, 5 ml kazeinszubsztrátumoldatot pipettázunk a centrifugacsőbe, és alaposan összekeverjük az enzimoldattal. A reakcióidő pontosan 40 perc. Ekkor 5 ml 11. reagenst pipettázunk a csőbe, és összekeverjük az oldattal. A csövet 30 percre vízfürdőre tesszük, hogy a csapadék koagulálhasson. Ezután a csövet 15 percig centrifugáljuk. Minden enzimoldattal vakpróbát hajtunk végre oly módon, hogy 5 ml 11. reagenst pipettázunk egy centrifugacsőbe, az oldatot 40 C°-ra melegítjük, majd hozzáadunk 1 ml enzimoldatot és 5 ml kazeinszubsztrátum-oldatot. A cső tartalmát alaposan összekeverjük, majd a csövet 80 percre vízfürdőbe tesszük. Ezután a csövet 15 percig centrifugáljuk. A tiszta oldat optikai sűrűségét 275 mu-nál desztilált vízzel szemben mérjük egy ultraibolya spektrofotométerrel. A próbaoldat és a vakoldat optikai sűrűségének különbsége (AOD) 0,4-0,6 legyen. Ha a különbség túlságosan nagy vagy túlságosan kicsi, új próbát kell végezni hígabb vagy töményebb enzimoldattal. A DE/g enzimtartalmu anyagban kifejezett enzimaktivitás a A OD X 11 X higitási tényező X 4,545 képlet alapján számítható ki. Ebben a képletben 11 az enzimoldatnak a szubsztrátummal és a 11. reagenssel való hígítását jelenti, a higitási tényező az enzimoldat összes milliliterének és a minta grammokban kifejezett súlyának hányadosa, és 4,545 egy átszámítási tényező. A találmányt a következő példák szemléltetik. 1. példa: Bacillus subtilis fermentálásával készült nyers proteázt vízben oldva kb. 100 000 DE/ml koncent-10 rációjú oldatot készítünk. Ezt beállítjuk 7 pH-ra. Az enzimoldathoz hozzáadunk 10tf% arányban egy 15s/tf%-os vizes hígított G-942 polimer oldatot (1:1 arányú maleinsav-sztirol kopolimer 24—26%-os vizes oldata). Csekély mennyiségű csa-15 padék képződik. A keveréket keverjük, és híg sósavval beállítjuk 5 pH-ra. Proteáz-polimer komplexből álló nagy mennyiségű csapadék képződik. Az igy kapott szuszpenziót 1 óra hosszat keverjük. A csapadékot szűrőre visszük, és kellő mennyiségű 20 acetonban szuszpendálva, majd szűrőn elválasztva mossuk. Ezután a csapadékot megszárítjuk. Az így kapott komplex proteáz készítmény tisztasága 2-4-szerese a tiszta kiindulási anyagnak. Az igy kapott komplex proteáz és egy hagyo-25 mányos módon készült proteáz készítmény tulajdonságai közötti különbséget a következő kísérletek szemléltetik. Mindkét készítményt feloldottuk vízben 100 000 DE/ml enzimaktivitásnak megfelelő koncentráció-30 ban, és nátriumhidroxid-oldat egyidejű hozzáadásával beállítottuk 9 pH-ra. Hozzáadtunk hjg Hyamine 1622 (p-terc-oktilfenoxietoxietil-dimetilbenzilammóniumklorid), oldatot. A példa szerint kapott komplex oldatában csapadék képződik, viszont a 35 másik enzimkészítmény oldatában nem kéződik csapadék. A cserzőszer enzimmentes híg oldatával végrehajtott vakpróbában szintén csapadék keletkezett Hyamine 1622 hozzáadására. Ebből következik, hogy a példa szerint kapott proteáz komplex-40 ben a cserzőszer résztvesz. Egy másik próbában a példa szerint készült proteáz komplexet és egy hagyományos módon készült készítményt összehasonlítottunk H. Haglund [Science Tools 14, 2. szám, 17 (1967)] 45 módszerével. A példa szerint készült komplex a próba során szilárd anyagból álló sávot mutat a kisebb pH-tartományban, és ez az anyag elválasztás és nagy pH-jú vízben való oldás után csapadékot képez Hyamine 1622-vel. Ennek az oldatnak az 50 ultraibolya spektruma azonos egy híg G-942 oldat ultraibolya spektrumával. A közönséges enzimkészítményei végzett próbában nem keletkezett szilárd anyagból álló sáv az említett pH-tartományban, és Hyamine 1622 hozzáadására nem mutatko-55 zott csapadék. Ez a próba is azt mutatja, hogy a példa szerint kapott készítmény különbözik a hagyományos módon előállított enzimkészítményektől, amennyiben az enzim komplexet képez a polimerrel. 60 Az 1. példa szerint készült enzim-polimer komplexet felhasználjuk a következő mosószer készítésére: Anyagok: súlyrész nátriumszulfát, vízmentes 54 65 nátriumtipolifoszfát 24 3