163794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szaramicetin elkülönítésére
163794 5 6 szójababliszt 2,0% nyers cukor 2,0% káliumdihidrogénfoszfát 0,1% disznózsírból préselt olaj 0,2% vízzel kiegészítve 100,0 %-ra> A táptalaj pH-ját sterilizálás előtt 7,0-ra állítjuk be. Oltóanyag-előállításra a Streptomyces saraceticus NRRL 2831 törzs ferde agar tenyészetét 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml folyékony táptalajba visszük. 48 óra hosszat forgó rázógépen 28°-on inkubálunk, majd a tenyészetet átvisszük egy 4 literes Erlenmeyer-lombikban levő 1 liter folyékony táptalajba. A forgó rázógépen 48 óra hosszat tartó inkubálás után a tenyészetet tartályban levő 3000 liter táptalaj beoltására használjuk. Kellő levegőztetés és keverés közben a tenyésztést 28°-on 48 óra hosszat folytatjuk. Ekkor a szaporító szakaszban kapott 3000 litert a termelő szakasz fermentorának beoltására használjuk, úgyhogy végül 37,850 liter térfogatot kapunk. A szaramicetin kellő levegőztetés és keverés közben végezve a fermentációt 28°-on 96 óra után éri el a legnagyobb koncentrációt. Mind a szaporító, mind a termelő szakaszában a habzást disznózsírból préselt olajjal gátoljuk. (2) A termék elkülönítése A szaramicetin kinyerésekor a táptalajt 10— 15°-ra hűtjük, és a habot Dow-Corning AF Antifoam habzásgátló emulzió hozzáadásával eltávolítjuk. 30%-os vizes oldatként annyi alumíniumszulfátot adunk hozzá, hogy literenként 5,0 g alumíniumszulfát legyen a folyadékban. Ezáltal az eredetileg 7,4 pH 4,3—4,6-ra csökken, majd 28%-os kénsav hozzáadásával a pH-t 3,5-re állítjuk be. Az így beszabályozott táptalajt előszűrőréteggel bevont forgó vákuumszűrőn szűrjük, és szükség esetén 2—5% Hyflo szűrést elősegítő anyagot adunk hozzá. A szűrőlepényt térfogatának 0,5 — 1,0-szeresét kitevő metanolban szuszpendáljuk, a szuszpenziót 1 óra hosszat keverjük, majd előszűrőréteggel bevont forgó vákuumszűrőn elválasztjuk. A metanolos kivonat pH-ját 50%-os nátriumhidroxid oldattal 7,0-ra állítjuk be, és vákuumban addig pároljuk be, amíg az összes metanol eltávozik, és tömény vizes oldat marad vissza. A kapott koncentrátum pH-ját 85%-os foszforsavval 3,5-re állítjuk be, és térfogatának 3/4 részét kitevő n butanollal háromszor extraháljuk. A butanolos kivonatokat egyesítjük, és pH-ját 50%-os vizes nátriumhidroxid oldattal 7,0—7,5-re állítjuk be, majd vákuumban legfeljebb 45°-on térfogatának egytizedére koncentráljuk. Tekintet nélkül arra, hogy a,z oldatban megjelenik-e szilárd anyag, háromszoros térfogatú n-hexánt adunk hozzá, hogy a nyers terméket tökéletesen kicsapjuk. A szuszpenziót 1 — 2 óra hosszat 5 — 10°-on hűtjük, majd a nyers terméket kerámiai anyagból készült vákuumszű•őn elválasztjuk, és hideg hexánnal mossuk. A ízűrőlepényt vákuumban 40°-on állandó súlyig izárítjuk. 37 850 liter folyékony táptalajból a kitermelés L0—12 kg világostól sötétig terjedő barnássárga színű por. A por elemzésével a következő adatokat kapjuk: mikrobiológiailag meghatározott titer 90 /z/mg kéntartalom 3,5% 5 ultraibolya spektrum: (MeOH) E|*ro = 220 190 m/j, Ez körülbelül 30— 35%-os tisztaságnak felel meg. A 30%-os vagy ennél tisztább poralakú nyers 10 terméket részlegesen dezaktivált alumíniumoxidon kromatografálva tisztítjuk 80%-os vagy ennél még tisztább termékké. Erre a célra 15% víz bekeverésével dezaktivált Woelm-féle lúgos alumíniumoxidot alkalmazunk. A kromatografáló oszlop 15 magasságának és átmérőjének aránya 2 : 1. A beadagolandó porból 4—5%-os metanolos oldatot készítünk, és azt átbocsátjuk az alumíniumoxiddal töltött oszlopon. A nagy tisztaságú antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és térfogatuk 20 egyhuszadára bepároljuk, majd a koncentrátumból a terméket ötszörös térfogatú aceton és hexán 50 : 50 arányú elegyének hozzáadásával kicsapjuk. A terméket tálcán gyorsan szétterítjük, és vákuumban 40°-on állandó súlyig megszárítjuk; így pisz-25 kosfehér vagy nagyon világos barnássárgás port kapunk. Szabadalmi igénypontok 30 1. Eljárás Streptomyces saraceticus fermentálásával termelt szaramicetin legalább 80%-os tisztaságban való elkülönítésére a fermentléből azzal jellemezve, hogy a fermentléből elkülönített szűrőlepényt metanolban szuszpendáljuk, a me-35 tanolos kivonatot elválasztjuk és közömbösítjük, majd a metanol eltávolításával vizes koncentrátumot állítunk elő, azt butanollal extraháljuk, közömbösítjük, és a butanolos kivonatot koncentráljuk, a butanolos koncentrátumot apoláris oldó-40 szerrel keverve 20—35% tisztaságú nyers terméket csapunk ki, és ezt a terméket tovább tisztítjuk azáltal, hogy oldatát részlegesen dezaktivált alumíniumoxiddal töltött kromatografáló oszlopon bocsátjuk át. 45 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a metanolban való szuszpendálásra metanolt vagy metanol és víz 50 : 1 és-15 : 1 közötti arányú elegyét használjuk. 50 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a metanolos extrahálás után kapott vizes koncentrátum pH-ját 3,2 — 3,7 értékre állítjuk be. 55 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a butanolos koncentrátumból a nyers terméket hexánnal csapjuk ki. 60 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a fermentléből a szuszpendálandó szűrőlepényt úgy állítjuk elő, , hogy a fermentlevet 25 — 5 C°-ra hűtjük, a pHL ját 3,7 — 3,2-re csökkentjük, és a szűrőlepény kinyeré-65 sere megszűrjük. 3
