163669. lajstromszámú szabadalom • Reagens glükoz meghatározására
163669 ABTS-mennyiség szükséges, amely a fent megadott mennyiség 1/200-ad része, vagyis 1—10 mg/l, előnyösen 2—5 mg/l. A reagensoldatban az azid, előnyösen egy alkáliazid, mint a nátriumazid, mely 0,05—0,2 g/l menynyiségben kerül alkalmazásra. A GOD és POD enzimeket a találmányunk szerinti reagensben olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy nem ezek, hanem a glükóz mutarotációja határozza meg a reakciósebességet. Ezt a követelményt a 2,5—15X103 egység (1 GOD-koncentráció és a 30—1000 egység) 1 POD-koncentráció elégíti ki. Az alkalmazott puffer a pH-értékét vizes oldatban 6,2 és 7,5, előnyösen 6,5 és 7,2 közé állítja be. Erre a célra minden, a reakciót nem gátló pufferanyag alkalmas. Előnyös a 7-es pH-jú foszfátpuffer alkalmazása. A triszpuffer nem bizonyult megfelelőnek. Vércukor meghatározására előnyös a következő találmány szerinti reagenskeverék: puffer (pH 6,2-től 7,5-ig) GOD 2,5—15 X103 egység/l POD 30—1000 egység/l azid 0,05—0,2 g/l ABTS 0,25—1,5 g/l, ill. 1—10 mg/l és adott esetben más kromogén adalékok, vizes oldat vagy a fenti összetételt biztosító megfelelő arányú szilárd anyagkeverékek alakjában. Különösen előnyös reagens a következő: 0,1 mólos foszfátpuffer (pH 6,5-től 7,2-ig) GOD 9— 12X103 egység/l POD 150—500 egység/l azid 0,1 g/l ABTS 0,5 g/l A találmány szerint további előnyös reagens még: 0,1 mólos foszfátpuffer GOD POD azid ABTS o-dianizidin (pH 6,5-től 7,2-ig) 9—12 xlO3 egység/l 150—500 egység/l 0,1 g/l 2—5 mg/l 50—70 mg/l Mint az a fentiekből kitűnik, a találmány szerinti reagens az alkotórészeket vizes oldatban is tartalmazhatja. Ez a vizes oldat igen tartós és összetételétől, különösen a felhasznált kromogénektől függően több héten keresztül tárolható károsodás nélkül. Ez jelentős javulást jelent az eddig alkalmazott reagensekkel összehasonlítva, amelyeknél egyrészt a kromogént és az enzimeket külön-külön oldatban kellett elkészíteni, másrészt ezek az oldatok nem voltak tárolhatók. A találmányunk szerinti reagens alkalmazásával elkerülhető, hogy több és csak rövid ideig felhasználható reagensoldatot kell előállítani. Az ismert reagensekből előállított oldatok csak egy napig voltak felhasználhatók. A találmány szerinti reagensek szilárd halmazállapotban is előnyösek, különösen a kiváló stabilitást tekintve; hűtőszekrény hőmérsékleten egy éven 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 túl is tárolhatók. Ezen túlmenően por vagy adott esetben pasztilla alakú szilárd keverékeik rendkívül könnyen oldódnak vízben. A találmány szerinti reagens további meglepő előnye az, hogy a POD-mennyisége jelentősen csökkenthető, mégpedig az eddigi 250 egység/l mennyiségről kb. 30 egység/l mennyiségre. Ennek ellenére a POD nem válik sebességmeghatározó reakciókomponenssé. Az említettek a POD jelentős megtakarítását teszik lehetővé. Az alábbi példák kapcsán részletesebben ismertetjük a találmányunk szerinti reagenst. 1. példa 9,50 g szék. nátriumfoszfátot, 4,6 g primer nátriumfoszfát-monohidrátot, 120 mg glükóz-oxidázt, 40 mg peroxidázt, 0,1 g nátriumazidot és 0,5 g ABTS-t golyósmalomban megőrlünk és ezt követően jói összekeverünk. Az így előállított reagens-keverék alkalmas 1 liter reagensoldat előállítására. A szilárd reagenskeverék — ebben a formában h4Cc hőmérsékleten egy éven túl tárolható. Glükóz meghatározására (pl. vérben) a fenti szilárd porkeverékből 1,5 g-ot oldunk 10&ml vízben Ez a reagensoldat tartalmazza a glükóz meghatá rozásához szükséges összes reagenst és +4C hőmérsékleten tárolva legalább 8 hétig felhasznál ható. 5 ml fenti reagensoldatot összekeverünk 0,2 m glükózt tartalmazó oldattal, (amit pl. vér vagy szé rum, egy ismert fehérjementesítő szerrel, — íg; perklórsavval vagy uranilacetáttal — végzett fehér jementesítéssel kaptunk). A keveréket 25 percij szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd mérjük Í képződött színezék intenzitását. Az intenzitás ara nyos az oldat glükóz-koncentrációjával. Ismer glükóz-tartalmú összehasonlító próbákkal végzet vizsgálatok alapján a kapott mérési eredmény köny nyen kiértékelhető. 2. példa A peroxidáz stabilitása Az 1. példában ismertetett reagensoldatot össze hasonlítottunk egy azonos összetételű, de ABTS-nem tartalmazó reagensoldattal, a peroxidáz akti vitásának különböző időpontban való meghatárc zásával. A következő táblázat szemlélteti a kapói eredményeket. ABTS nélküli reagens ABTS-t tartalmazó reagens 0 hét, 33 C° 1 hét, 33 C° 3 hét, 33 C° 100% 35% 4% 100% 67% 30% 65 A kapott eredmények igazolják, hogy a talá mány szerinti reagensoldat peroxidáz-aktivitáí 2
