163661. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-tripszin-inhibitor izolálására szarvasmarha szerveiből
163661 5 6 gy előállított kallikrein-tripszin-inhibitor kísérő jolipeptid szennyeződést és sókat nem tartalmaz. \ specifikus aktivitás 3000—4000 KIE/mg szárazmyag. A kitermelés a nyerskivonat gátlási kapacitásának 60—80%-a 30—40-szeres dúsítással. 1. példa 700 g szarvasmarha-tüdőt a kötőszövetektől megtisztítunk és finomra darálunk, 1,8 liter metanolban, 21 g kalciumklorid hozzáadásával 1 óra hosszat keverünk 40 C°-on. Lehűlés után a szuszpenziót centrifugáljuk és a folyadékot vákuumban forgóbepárlóban 275 ml-re betöményítjük. A metanolt teljesen el kell távolítanunk. Az oldat pH-értékét 2n sósav hozzáadásával 1,5-re állítjuk be, majd ezt követően ismét centrifugáljuk. A maradék 880 000KIE-t tartalmaz. Ezt az oldatot a következő oszlopokra öntjük: 50 g 330 m2 /g felülettel rendelkező polisztirolgyantát (Lewapol Ca 9221) metanolban elkeverünk és addig mossuk, míg a metanol gyakorlatilag mentes az UV (280 nm)-ban adszorbeáló anyagoktól. A metanolt ezt követően dekantáljuk és felforralt desztillált vízzel helyettesítjük. A gyanta vizes oldatát (kb. 100 ml) egy 3 cm átmérőjű és 30 cm magas üvegoszlopba légbuboréktól mentesen leöntjük és 200 ml vízzel mossuk. Az inhibitor-tartalmú nyers kivonatot 100 ml/óra átfolyási sebességgel az oszlopra adagoljuk. Ezt követően az anyagot 200 ml, 0,01 mólos sósav oldattal, majd ezután 200 ml, 0,02 mólos etiléndiamintetraecetsav-nátriumsóval és 100 ml vízzel mossuk. Az inhibitort ezután 1 liter vízből és 1 liter 80%-os metanolból álló lineáris koncentráció-fokozatú oldatokkal eluáljuk és frakcionálva felfogjuk. Az ismert tripszines módszerrel inhibitor-tartalmúnak talált frakciókat ezután egyesítjük, a metanolt vákuumban elpárologtatjuk és a vizes oldatot lioíilizáljuk. Ezzel az eljárással 714 000 KlE-vel rendelkező, 180 g inhibitort kapunk, amely a felhasznált gátlási kapacitás 81 %-a. A fajlagos aktivitás 3960 KíE/mg. 2. példa 4 kg őrölt szarvasmarha-tüdőt 7,2 liter desztillált vízben elkeverünk. 10 perc keverés után 350 ml 10 térfogat %-os kénsavat adunk hozzá, míg a pH-érték 1,9 nem lesz. Az elegyet 12,0 literrel feltöltjük, 200 ml toluolt adunk hozzá és egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. A szuszpenziót 10 percig 4800 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A maradék össz-aktivitás 8,15XlOG KIE. Keverés közben 30 perc alatt annyi ammóniumszulfátot adunk az anyaghoz, míg a telítettség 0,45 nem lesz. A pH-értéket koncentrált kénsavval 1,5-re beállítjuk, szűrőanyagként 320 g kovaföldet adunk hozzá és azonnal szűrjük. A fenti oldatból 7,0 litert (össz-aktivitás 4,38 X106 KIE) körülbelül 2 liter, 150 m3 /g felülettel rendelkező porózus polisztirolgyantát (Lewapol Ca 9255) tartalmazó oszlopra öntünk. Az oszlopot előzőleg In metanolos sósavoldattal, metanollal és vízzel mossuk. Az extraktum átfolyása után az oszlopot 4 liter 0,01 n sósavoldattal, 4 liter 0,02 mólos etiléndiamintetraecetsav-nátriumsó oldattal és 2 liter desztillált vízzel mossuk, ezt követően 5 liter desztillált vízből és 5 liter 80%-os metanolból álló lineáris koncentráció-fokozatú oldatokkal eluáljuk. Az ak-5 tív frakciókat egyesítjük, a metanolt vákuumban ledesztilláljuk és az oldatot liofilizáljuk. Áz eljárással 2500 KIE/mg (össz-aktivitás 3,22xl06 KIE) fajlagos aktivitással rendelkező 1,3 g anyagot kapunk, mely mennyiség 73,5 %-os kitermelésnek felel meg. 10 3. példa 120 kg szarvasmarha-tüdőt az 1. példában leírt eljárás szerint metanolos kalciumklorid oldattal feltárunk. Az előállított 400 liter tiszta szűrletből a 15 metanolt gondosan ledesztilláljuk. A vizes, a kallikrein-tripszin-inhibitort nyers alakban tartalmazó oldatot sósavval 1,5 pH-értékre megsavasítjuk, majd 8 liter, grammonként 150 m2 felülettel rendelkező porózus polisztirolgyantát (Lewapol Ca 9255) 20 tartalmazó oszlopra öntjük. Össz-aktivitás: 152 X106 KIE. Az oszlopot 16 liter, 0,01 n sósavoldattal, 16 liter 0,02 mólos EDTA oldattal és 10 liter desztillált vízzel mossuk. Ezután a hatóanyagot 20 liter desztillált vízből és 20 liter 80%-os metanolból álló lineá-25 ris koncentrációfokozatúp oldatokkal eluáljuk. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, a metanolt ledesztilláljuk és az oldatot liofilizáljuk. 25,7 g szilárd anyagot kapunk, melynek fajlagos aktivitása 4200 KIE/mg (össz-aktivitás 108 X 106 30 KIE), amely 71 %-os kitermelésnek felel meg. 4. példa 120 g szarvasmarha-tüdőt az 1. példa eljárása szerint metanolos kalciumklorid-oldattal elkeverve, 35 a metanol eltávolítása, a pH-érték 1,5-re való beállítása és centrifugálás után 67 ml terméket kapunk, 150 000KIE-értékkel. Az inhibitor ezen nyers oldatába 10 ml porózus polisztirolgyantát (Lewapol Ca 9255, grammon-40 ként 150 m2 felülettel) keverünk. 30 perc után a gyantát nuccson szűrjük és 100 ml vízzel mossuk. A gyantát ezután 20 ml izopropanol oldatában vízzel 100 ml-re feltöltjük, szuszpendáljuk és 30 percig keverjük. A gyantát szűréssel eltávolítjuk és a szürletben 45 az inhibitort — az izopropanol vákuumban történő ledesztillálása után — meghatározzuk. Kitermelés 123 000 KIE, az alkalmazott gátlási kapacitás 82 %-a. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás a kallikrein-tripszin-inhibitor dúsítá-55 sara, illetve leválasztására az inhibitort tartalmazó vizes oldatokból adszorpciós anyagok felhasználásával és ezt követő deszorpcióval, azzal jellemezve, hogy adszorbensként sztírolból és divinilbenzolból készített, nem-ionogén, vízben oldhatalan, pórusos 60 szerkezetű, térhálós polimerizátumot alkalmazunk, amelynek aktív felülete 10—1000 m2 /g, majd az adszorbeált inhibitort, célszerűen vízzel vagy vizes oldattal történő mosás után, eluáljuk az adszorbensről. 65 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 3
