163588. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 7béta- (D-5-amino-5-karboxi-valeramido) -3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-CEF-3-AM-4-karbonsav antibiotikum előállítására
163588 13 14 E vizsgálatokat a kórokozók halálos adagjának többszörösével fertőzött egereken végeztük; az állatokat a fertőzéssel egyidejűleg, majd 6 óra múlva újból kezeltük az antibiotikummal. A kísérletek eredményeit az alábbi táblázatban foglaltuk össze: A 842 A antibiotikum aktivitása in vivo ,,. ., . ED5 o s. c. beadás esetén Vizsgált mikroorganizmus két adag; mcg . ban XI. tápközeg: élesztő (Amber Yeast 300) 10,0 g szeszlepárlási maradék-kivonat 20,0 g desztillált víz 1000 ml pH = 7,0 Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morganii 3202 Salmonella schottmuelleri Klebsiella pneumoniae AD Klebsiella pneumoniae B Paracolobactrum arizoniae Escherichia coli Aerobacter aerogenes Pasteurella multocida Salmonella typhosa Diplococcus pneumoniae E400 51 276 276 103 125 125 125 200 49 57 34 566 A 842A antibiotikum termelése fermentáció útján A 842A antibiotikumot a Streptomyces lactamdurans mikroorganizmussal, megfelelő körülmények között, erre alkalmas vizes tápközegben végzett aerob fermentáció útján termeljük. Tápközegként általában bármely oly ismert tápközeg alkalmazható, amely szénforrást és nitrogénforrást tartalmaz a termelő mikroorganizmus számára. A tápközegben alkalmazandó szénhidrát ill. nitrogénforrás pontos mennyisége függ a jelenlevő egyéb alkotórészektől is; általában azonban a szénhidrát koncentrációja kb. 1—6 súly% lehet a tápközegben, a hasznosítható nitrogén mennyisége pedig általában kb. 0,2—6 súly% lehet a tápközeg teljes súlyára számítva. Alább példaként megadunk néhány oly tápközeg-összetételt, amelyek jól alkalmazhatók a 842A antibiotikum termelése során. Ezek a tápközeg-összetételek azonban kizárólag szemléltető példák; a találmány szerinti eljárás semmiképpen sincs ezekre a példaképpen megadott összetételekre korlátozva. IX. tápközeg: élesztő („Amber Yeast 300") 10,0 g szeszlepárlási maradék-kivonat 20,0 g dextróz 10,0 g desztillált víz pH=7,0 1000,0 m X. tápközeg: szójaliszt (Staley 4S) 30,0 g szeszlepárlási maradék-kivonat 7,5 g Cerelose 20,0 g NaCl 2,5 g CaC03 (a pH-érték 7,0-ra való beállítása után) 10,0 g desztillált víz A fermentációt 20 C° és 37 C° közötti hőmérsékleten folytatjuk le; optimális eredmények elérése 10 érdekében célszerű 24—32 C°-on dolgozni. A Streptomyces lactamdurans MB—2908 törzs tenyésztésére és a 842A antibiotikum termelésére szolgáló tápközeg pH-értéke célszerűen 6,0 és 8,0 között legyen. 15 A 842A antibiotikum kis méretben történő fermentáció útján való előállítása esetében a fermentációt célszerűen oly módon folytatjuk le, hogy egy erre alkalmas tápközeget beoltunk az antibiotikumot termelő mikroorganizmus kultúrájával és a 20 fermentációt 28 C° körül állandó hőmérsékleten, rázóasztalon néhány napig folytatjuk. Az inkubációs időszak befejeztével a micéliumot eltávolítjuk a fermentációs termékből és a tiszta folyadékban meghatározzuk a termelt antibiotikum mennyisé-25 gét. A gyakorlatban ezt a fermentációt sterilizált palackban folytatjuk le, egy, két, három vagy négy fokozatban termelt inokulummal. A tápközeg valamennyi fokozatban fentebb említett IX.—XI. 30 tápközegek valamelyike, vagy általában bármely más, megfelelő szénforrást és nitrogénforrást tartalmazó tápközeg lehet. Az inokulum termelése során a lombikban elhelyezett kultúrát 28 C° állandó hőmérsékletű kamrában kb. 1—3 napig rá-35 zatjuk, majd az így tenyésztett kultúrát oltjuk át a következő inokulum-termesztési fokozatba ill. az antibiotikumot termelő fermentációba. Az inokulum termelése során a további fokozatokat — amennyiben ilyeneket alkalmazunk — lényegileg 40 ugyanolyan módon termesztjük, mint ahogyan fentebb az első fokozat esetében leírtuk, vagyis a beoltott lombikokat állandó hőmérsékleten néhány napig rázatjuk és az inkubációs időszak befejeztével a kapott kultúrát tovább oltjuk. A termelő 45 kultúrában az inkubációs időszak befejeztével a lombik tartalmát centrifugáljuk, a micéliumot centrifugálással elkülönítjük, a szupernatáns folyadékot betöményítjük és a kinyert 842A antibiotikumot tisztítjuk. 50 Nagyobb méretű antibiotikum-termelés esetében a fermentációt keverőberendezéssel és szellőzésre alkalmas szervekkel felszerelt tartányban folytatjuk le. A tápközeget a tartányban készítjük el, majd kb. 120 C°-ig menő hőmérsékletre való fel-55 hevítés útján sterilizáljuk és lehűtés után beoltjuk a sterilizált tápközeget a termelő kultúrával. A fermentációt néhány napig, pl. 2—4 napig folytatjuk, miközben a tápközeget keverjük és/vagy szellőztetjük, 28 C° körüli hőmérsékleten. Az inoku-60 lum előállításának, valamint a tápközeg összetételének a megfelelő változtatása útján az antibiotikum-termelés további javítása ill. a hozam növelése érhető el. A 842A antibiotikum mennyiségi meghatározása 1000,0 ml 65 Vibrio percolans mikroorganizmus segítségével: 7
