163467. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus aktivitású proteáz izolálására
163467 Sephadex G—25 oszlopon szűrik, majd az aktív eluátumot liofizálják. 1 A 3 281 331 sz. USA-beli szabadalmi leírás eljárást közöl fibrinolitikus hatású proteáz előállítására, amit oly módon végeznek, hogy az Aspergiilus oryzae, Aspergillus flavus vagy Absidia coerulea nyers enzimkeverékeinek oldatából a hatóanyagot 5,5 pH-értéken CM-Cellulose. vagy CM-Sephadex oszlopon abszorbeálják, puíferral 7 pH-értéken isluálják, majd dialízis után liofílizálják, vagy pedig a hatóanyagot tanninnal kihatású, toxikus mellékhatások nélkül terápiásán alkalmazható proteáz előállítására, oly módon, hogy az Aspergillus ochraceus tenyészetéből tanninos kicsapással izolált nyers enzimkeveréket vizes pufferoldattal 5 extraháljuk, a hatóanyagtartalmú extraktumot kevéssé térhálós dextrán dietilaminoetil-származék vagy dietilaminoetil-cellulóz (DEAE-Sephadex vagy DEAE-Cellulose) anioncserélőn szűrjük, a hatpanyagtartalmú szürletből a hatóanyagot vízzel elegyedő szerves oldószerrel 10 kicsapjuk, a csapadékot vákuumban szárítjuk, vízben oldjuk, majd (Sephadex G—75 vagy Sephadex G—100) térhálós dextrángélen kromatografáljuk és a proteáztartalmú frakciókat liofilizáljuk. csapják, 6 pH-értéken DEAE-Cellulose oszlopon adszorbeálják és a sókoncentráció fokozatos növelése mellett puíferral eluálják. A Chemical Abstracts 54, 17549 d referátuma egy eljárást ismertet, amely szerint Aspergillus ochraceus kor- 15 pakultúráját 0,75%-os nátriumklorid oldattal extrahál« Ják, és a hatóanyagot az alábbi művelet-sorral tisztítják: kalciumacetát és ammóniumszulfát oldattal kicsapást végeznek, ammóniumszulfáttal extrahálnak, káliumcianid oldattal szemben dializálnak, rivanollal kicsapást 20 végeznek, Amberlite IRC—50-en kromatografálnak, acetonnal és rivanollal kicsapást végeznek, Amberlite IRC 50-nel ismételten kromatografálnak, acetonnal frakcionált kicsapást végeznek* majd etanol tartalmú oldatból kristályos alakban egy proteolitikus enzimet 25 nyernek ki. A Chemical Abstracts 56, 5103 b referátumban az Aspergillus ochraceusból nyert proteáz preparátum tisztítását írják le. A termék fibrinolitikus hatására vonatkozóan azonban nem közölnek adatokat. A tiszti- 30 tás során az alábbi műveleteket alkalmazzák: kisózás, oldósueres frakcionálás, kalciumfoszfátgéles adszorpció, ezeket a műveleteket a találmány szerinti eljárásban nem alkalmazzuk. A Chemical Abstracts 65, 4548 e referátum egy fér- 35 mentációt ismertet, amelyhez Aspergillus ochraceus törzset alkalmaznak. A fermentáció során ellenőrzik a proteolitikus aktivitás csökkenését. Proteázok elkülönítésére azonban nem tettek kísérletet. Az összes ismert eljárások a fibrinolitikus hatású 40 proteázoknak Aspergillus oryzae, Aspergillus terricola, Aspergillus flavus, Aspergillus áwamori vagy Absidia cöerülea gombákból történő izolálására vonatkoznak. A leírt módszerek a proteázok különböző molekulaszerkezete és az ebből adódó specifikus fizikokémiai 45 tulajdonságai következtében a fibrinolitikus hatású enzimnek csak á megadott penészgombafajból történő izolálására használhatók. Némely módszer ezenkívül csak részlegesen tisztított proteázpreparátumot eredményez, ami terápiás fel- 50 használhatóságukat korlátozza. A találmány célja eljárás kidolgozása fiziológiás körülmények között optimális fibrinolitikus hatású, nagytisztaságú proteáz gazdaságos izolálására Aspergil- 55 lus ochraceusból. Az így kapott proteáz a terápiában külsőleg és parenterálisan toxikus mellékhatások nélkül alkalmazható. • A találmány feladata az Aspergillus ochraceus nyers enzimkeverékéből nagytisztaságú fibrinolitikus hatású proteáz izolálása. Mindenekelőtt szükség volt ehhez egy olyan módszerre, amellyel a proteáz a fibrinolitikusan inaktív proteázoktól, ballasztfehérjéktől és zavaró színezékek mellől gazdaságosan izolálható. . A találmány tárgya eljárás nagy tisztaságú fibrinolitikus A nyers enzimkeverék tisztítását úgy végezzük, hogy a nyers preparátumot, melynek proteolitikus aktivitása kb. 1 CE/mg, 6,5—7,5 pHrértékű trisz-HCl-pufferral vagy 6,5—7,5 pH-értékű 0,05—0,1 mólos ammóniumacetát puíferral szobahőmérsékleten többször kikeverjük és ily módon a hatóanyagot tökéletesen feloldjuk. Centrifugálással (15000 g) tiszta, sötét színű, hatóanyagtartalmú, az oldhatatlan inaktív részektől elkülönített oldatot állítunk elő. Fenti hatóanyagtartalmú extraktumot előnyösen 0—4 C°-on 0,5—0,9 mekv./g kapacitású kevéssé térhálós dextrán dietilaminoetil-származék vagy dietilaminoetil-cellulóz anioncserélő oszlopon szűrjük. Ezt követően az ioncserélőt az extraháláshoz használt pufferral mossuk. , Az anioncserélővei végzett kezeléssel a ballasztfehérjéket, a fibrinolitikus terápiához nem megfelelő proteázokat, valamint a színezékek legnagyobb részét megkötjük. A fibrinolitikus hatású proteázok nem adszorbeálódnak; ezeket a fenti módon kapott hatóanyagGldatból háromszoros mennyiségű, —20 C°-ra lehűtött, vízzel elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen etanollal kicsapjuk és vákuumban szárítjuk. A hatóanyagtartalmú anyagot lehetőleg kevés vízben feloldjuk és kromatografáljuk oly módon, hogy az oldatot előnyösen 0— +4 C°-on 7—11 ml/g vízfelvevőképességű térhálós dextrángéllel (Sephadex G—75 vagy G—100) töltött oszlopra visszük, majd az oszlopot vízzel eluáljuk. Az eluálásnál kapott frakciók proteolitikus aktivitását megmérjük. Az aktív frakciókat liofilizáljuk. Száraz fehér por alakjában tiszta fibrinolitikus hatású proteázt kapunk, amelynek proteolitikus aktivitása kb. 15 CE/mg. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy az Aspergillus ochraceusból kapott nyers enzimkeverékből egyszerű technikai segédeszközökkel fiziológiás körülmények között aktív, nagy tisztaságú, fibrinolitikus hatású proteázt izoláljunk. A találmány szerinti eljárás haladó jellegét igazolják az elért hozamok. A tisztítás első fázisában (extrahálás, szűrés, a hatóanyag kicsapása) a hozam az 1. példában az aktivitások alapján 73,4%. A tisztítás második fázisában (gélkromatográfia és a hatóanyagtartalmú eluátum liofilizálása) az 1. példában a hozam az aktivitások alapján 55,6%. Kb. 11-szeres töményítésnél a két tisztí- 60 tási fázisban az összes aktivitás-hozam 40,8%. A találmány szerint izolált fibrinolitikus enzimek elektroforézissel egységesek. A fibrinolitikusan aktív proteáz külsőleg vagy parenterálisan alkalmazva, terápiás körülmények között 65 semmiféle toxikus mellékhatást nem okoz. ■ \ ' V
