163453. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-3-metil-delta3-cefem-4-karbonsav előállítására

11 163453 12 Az elegyet 20 liter/perc sebességgel levegőztetjük és 300 fordulat/perc sebességgel keverjük. A fermentáció lezajlása után a sejteket Westfalia gyártmányú szeparátor-centrifugával eltávolítjuk, és a szűrt fermentlevet 30—35 °C külső hőmérsékleten eredeti térfogatának 1/3-részére bepároljuk. A koncentrátumot 60%-os acetontartalom eléréséig acetonnal elegyítjük, a kivált csapadékot leszűrjük és szárítjuk. 25,5 g enzimkészítményt kapunk. 4. példa 4 g, a 2. példa szerint előállított enzimet 500 ml vízben oldunk, és a kapott oldatot 1 n vizes nátriumhidroxid^ oldattal pH = 7,5-re lúgosítjuk. Az oldathoz 2 g 7-fenoxiacetamido-3-metil-A3

-cefem-4-karbonsav-nátriumsót adunk, és a kapott elegyet 15 órán át 37 °C-on tartjuk. A kapott folyadékból Dia Filter—G—10H szűrőanyaggal (a Nippon Vacuum Technique Co. cég gyártmánya) eltávolítjuk a fehérjéket, az elegyet 1 n sósavoldattal pH = 2,5-re savanyítjuk, a térfogat felének megfelelő mennyiségű butilacetáttal háromszor mossuk, majd 1 n vizes nátriumhidroxid-oldattal pH = 6,5-re lúgosítjuk. A kapott folyadékot 2 X15 cm méretű Dowex 1—X8 ioncserélő gyanta-oszlopon (ecetsavforma) adszorbeáltatjük, és 1 n ecetsav-oldattal eluáljuk. Az egyes frakciók adszorpcióját 260 fi-on mérjük (vagy az egyes frakciók mintáit fenoxiacetilkloriddal átitatott szűrőpapíron biológiai vizsgálatnak vetjük alá), a 7--amino-3-metil-A3-cefem-4-karbonsavat tartalmazó frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk. A szárított terméket a lehető legkisebb mennyiségű desztillált vízben feloldjuk, a kapott oldatot 1 n sósavoldattal pH = 3,7-re savanyítjuk, majd éjszakán át jeges hűtés közben állni hagyjuk. A kivált színtelen kristályokat a lehető legkisebb mennyiségű jeges vízzel mossuk, majd acetonnal mossuk, végül szárítjuk. 792 mg (69,6 %) 7-amino-3--metil- A3

-cefem-4-karbonsavat kapunk;

op.: 240—242 C

C (bomlás közben). Elemzés: a Cg

H

10

N

2

O

3

S képletre számított: C = 44,85 % H = 4,70 % N = 13,08 %; talált: C = 45,02 % H = 4,58 % N = 12,95 %. 5. példa 10 mg, a 2. példa szerint előállított enzimet 5 ml 1 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH =7,5) oldunk, az oldathoz 5 mg 7-fenilacetamido-3-metil-A3

-cefem-4--karbonsav-nátriumsót adunk, és az elegyet 5 órán át 37 °C-on tartjuk. Ezután a korábban ismertetett 1. módszer szerint meghatározzuk a 7-fenilacetamido-3-metil-A3

-cefem-4-karbonsav bomlásának mértékét,-és a 7-ADCA hozamát. Méréseink szerint ez a két érték 95 %, ill. 91%. 6. példa A 4. példában leírt eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy 7-fenoxiacetamido-3-metil-A3

-cefem-4-karbonsav-nátriumsó helyett 7-fenilacetamido-3-metil-A3

-cefem-4-karbonsav-nátriumsóból indulunk ki. 849 mg (73,5%) 7-amino-3-metil-A3

-cefem-4-karbonsavat kapunk, op,: 239—241°C (bomlás). 7. példa 10 liter, a 2. példában ismertetett módon előállított szűrt Bacillus megaterium B—400 FERM—P No. 748 5 fermentlevet ecetsavval kb. pH=7-re semlegesítünk. A szűrt fermentléhez 500 g diatómaföldet adunk, és a kapott elegyet kb. 30 percig keverjük. Ezalatt az elegy pH-ját semleges értékeh (pH = 7) tartjuk. A reakcióelegyet kosaras szeparátor-centrifugán centrifugáljuk, 10 majd a szilárd anyagot vízzel mossuk. 750 g nyers celit-enzim adszórbátumot kapunk (enzimtartalom: 1200 egység/g). * :

^

: 8. példa .-'•'••-•• 15 A 2. példában ismertetett módon előállított, szűrt Bacillus megaterium B—400 FERM—P No. 748 fermentlevet kb. pH=7-re semlegesítjük. A fermentlét 1 literes frakciókra osztjuk, és az egyes frakciókhoz 20 50—50 g adszorbenst adunk. A következő adszorbenseket használjuk fel: celit (HyÄo Super Cel), aktív szén (kromatográfiás minőség, a Wako Jun-yaku Co. cég gyártmánya), CM-Cellulose Ion-Exchanger (a Serva Co. cég gyártmánya, és Amberlite CG—50 (hidrogénfórrna). 25 Az elegyet kb. 30 percig keverjük, ezalatt az elegy pH-ját állandóan semleges (kb. 7) értéken tartjuk. Ezután az egyes hordozóanyagokat leszűrjük, vízzel mossuk, és nedvesen tároljuk. Az egyes hordozóanyagokon adszorbeált enzim mennyiségét a celiten adszorbeált 30 enzimmennyiséghez viszonyítva (100%) a következő táblázatban adjuk meg: Adszorbeált enzim, Hordozóanyag a celiten adszorbeálthoz viszonyítva, % celit 100 aktív szén 100 CM-Cellulose 100 Amberlite CG—50 81,2 45 9. példa A 8. példa szerint előállított dezacilező enzim — celit adszórbátumot (enzimtartalom: 1800 egység/g) 0,01 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH = 7,5) mossuk, köpeny-50 nyel körülvett, 5 X 50 cm méretű csőbe töltjük, majd a kapott oszlopot meghatározott áramlási sebesség betartásával (férsebesség = 0,5) 1 órán át a fenti pufferoldattal mossuk. A cső köpenyében 37 °C-os vizet áramoltatunk, és így 55 az oszlop külső hőmérsékletét meghatározott értéken tartjuk. Ezután az oszlopon 6 liter vizes 7-fenilacetamidb-3-metil-A3

-cefem-4-karbonsav-nátriumsót (szabad savban kifejezett koncentráció: 5 mg/ml) bocsátunk át meghatározott áramlási sebességgel (térsebesség =0,5), 60 és az effluenst 10,8 ml-es frakciókba gyűjtjük. A teljes oldatmennyiség átáramoltatása kb. 16 órát vesz igénybe. A kapott 6,4 liter effiuens pH-ját 6-ra állítjuk, majd az effluenst térfogatának kb. 1/10-részére bepároljuk. A koncentrátumot 6 n sósavoldattal pH = 3,7-re sava-65 nyitjuk. Ekkor megindul a 7-ADCA csapadék kiválása. 6