163453. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-3-metil-delta3-cefem-4-karbonsav előállítására
5 163453 6 Industrial Science § Technology, Japán intézetben helyeztük letétbe. (Deponálási szám: BIKOKEN 503). A találmány tárgya tehát eljárás 7-ADCA előállítására. A találmány szerint eljárhatunk úgy, hogy valamely 7-fenilacetamido-3-metil-A3 -cefem-4-karbonsav vízben oldódó sóját vizes közegben a Bacillus nemzetséghez tartozó, dezacilező enzimet termelő törzs tenyészetéből származó enzimkészítménnyel kezeljük. Ezzel az eljárással nagy hozammal kapjuk a 7-ADCA-t; az eljárás azonban nagyüzemi szempontokból nem elég előnyös. Az eljárás hátrányai közé tartozik, hogy a dezacilező enzimet el kell különíteni a dezacilező enzimet termelő törzs tenyészetéből, továbbá a 7-ADCA kis koncentrációban képződik, így csak bonyolult és költséges műveletekkel különíthető el a folyékony reakcióközegtől. Hátrányt jelent az is, hogy a dezacilező enzimet ismételten már nem lehet felhasználni. A fenti hátrányokra tekintettel a további kísérletekben a dezacilező enzimet szilárd fázisban reagáltattuk. Azt találtuk, hogy ha a dezacilező enzimet termelő törzs szűrt fermentlevét meghatározott hordozóanyagokkal elegyítjük, a hordozóanyag az inaktiválódás veszélye nélkül stabilan adszorbeálja az enzimet, és a hordozóanyagról az enzim vizes mosással nem távolítható el. Ha valamely 7-fenilacetamido-3-metil-A3 -cefem-4-karbonsav vízben oldódó sójának vizes oldatát enzimmel kezelt hordozóanyagból álló oszlopon bocsátjuk át, az effiuensben igen nagy koncentrációban jelenik meg a 7-ADCA. További előnyt jelent, hogy az enzim folyamatosan bontja el a 7-fenilacetamido-3-metil-A3 -cefem-4-karbonsavat, azaz az enzim hatékonysága igen nagy. A találmány tárgya a fentieknek megfelelően eljárás a (II) képletű 7-ADCA előállítására, amelynek során valamely (I) általános képletű 7-fenilacetamido-3--metil-A3-cefem-4-karbonsav-származékot — ahol R benzil- vagy fenoximetil-csoportot és M vízben oldódó só kialakítására képes alkálifématomot jelent — az (I) általános képletű vegyület amid-kötésének elbontására alkalmas enzimet termelő, Bacillus-nemzetségbeli törzs szűrt fermentlevével kezelünk, vagy az (I) általános képletű vegyületet vizes közegben a fenti enzimtermelő törzsből származó enzimkészítménnyel kezeljük. A 7-ADCA-t a találmány szerint továbbá úgy is előállíthatjuk, hogy az (I) általános képletű vegyületeket dezacilező enzimet az enzimet nem inaktiváló hordozóanyagon adszorbeáltatjuk, az adszorbátumot az (I) általános képletű vegyület vizes oldatával hozzuk érintkezésbe, és a reakcióelegyből elkülönítjük a 7-ADCA-t. A találmány szerinti eljárással új módszerrel, enzimes úton állítjuk elő az értékes gyógyászati hatással rendelkező cefalosporin-antibiotikumok egy közbenső termékét. A találmány szerint a 7-ADCA-t nagyüzemi szempontból is előnyös módszerrel állíthatjuk elő úgy, hogy az enzimes reakciót szilárd fázisban, folyamatos üzemben hajtjuk végre. A hordozóra felvitt dezacilező enzimet az inaktiválódás veszélye nélkül ismételten is felhasználhatjuk. A találmány szerinti eljárásban dezacilező enzimként pl. a Bacillus megaterium B—400 FERM—P No. 748 törzs által termelt enzimet alkalmazhatjuk. Az (I) általános képletű vegyületek amid-kötésének bontására a találmány szerinti eljárásban felhasznált enzimet úgy állítjuk elő, hogy a Bacillus megaterium B—400 FERM—P No. 748 törzset aerob körülmények között, 25—37 pC-on, 12—60 órán át tenyésztjük Táptalajként baktériumok tenyésztésére általánosan alkalmazható közegeket, pl. megfelelő mennyiségű nit-5 rogénforrást (így peptont, húskivonatot, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, szárított élesztőt, szójabab-fehérje bomlástermékeket vagy szójabab kilúgozásával kapott oldatot), szénforrást (pl. melaszt, glükózt vagy glicerint), szervetlen sókat és adott esetben egyéb növekedés-10 serkentő anyagokat tartalmazó elegyeket használhatunk fel. A folyékony tenyészeteket általában levegőztetéssel keverjük. A fenti enzim normál körülmények között exo-enzim, és a sejtmentes szűrt fermentleben fordul elő. Az enzi-15 mes reakcióhoz ezért az enzimet a szűrt fermentlé formájában, vagy a szűrt fermentléből készített egyéb enzimpreparátumok formájában használjuk fel. Az enzimkészítmények előállítása során az enzimet ismert tisztítási műveleteknek vetjük alá. Az enzimkészítményeket 20 pl. a következőképpen állíthatjuk elő: a szűrt fermentlevét adott esetben betöményítés után valamely vízbeö oldódó sóval, így ammóniumszulfáttal vagy nátriumkloriddal részben vagy teljes mértékben telítjük, és Igf az enzimet kicsapjuk; vagy az enzim kicsapása érdeké-25 ben az adott esetben betöményített szűrt fermentléhéz hidrofil szerves oldószert, pl. metanolt, etanolt vagy acetont adunk. A csapadékot vízben oldjuk, és a kapott oldatot félig áteresztő membrán felhasználásával dializáljuk. Az utóbbi művelettel eltávolítjuk a kis mole-30 kulasúlyú szennyezőanyagokat. A tisztításhoz felhasználhatjuk az enzim és a szennyezőanyagok meghatározott adszorbensekkel vagy gélszűrőkkel szemben mutatott adszorpciós affinitásának eltérését is. Ennek megfelelően a fermentleben jelenlevő kismolekulasúlyű 35 szennyezéseket, színes anyagokat, fehérjéket és hasonló szennyezőanyagokat önmagában ismert módszerekkel, pl. adszorpciós kromatográfiával, ioncserés kromatográfiával vagy gélszűréssel egyszerűen és hatékonyan eltávolíthatjuk. A fenti műveletekben kapott enzim-40 tartalmú oldatot csökkentett nyomáson betöményíthetjük vagy fagyasztva száríthatjuk, és így szilárd halmazállapotú standard enzimkészítményt kapunk. Természetesen a kapott enzimtartalmú oldatot közvetlenül is felhasználhatjuk az (I) általános képletű vegyületek dezäci-45 lezésére. Ha az enzimkészítményt tovább kell tisztítani, a további tisztítást a fehérjék és enzimek feldolgozásában általánosan ismert módszerekkel, pl. adszorbens vagy gélszűrő felhasználásával végezhetjük. 50 Az enzimes reakciót rendszerint úgy végezzük, hogy az (I) általános képletű vegyületet vízben vagy puffefoldatban oldjuk, és ezt az oldatot kezeljük a fenti enzimkészítménnyel. Az (I) általános képletű vegyületeket vízben oldódó kálium- vagy nátriumsóikká alakítjuk, 55 és a vizes oldat koncentrációját 0,1—20 mg/ml, előnyösen kb. 2—5 mg/ml értékre állítjuk be. A reakcióelegy pH-ját előnyösen 7 és 8 közötti értéken tartjuk* A reakciót 30—45 °C-on, előnyösen kb. 35—40 °C-on hajtjuk végre. A reakcióidő a reakciókörülményektől függően 60 változik, a reakció azonban rendszerint 5—30 óra alatt végetér. A reakciót megszakíthatjuk abban az időpontban, amikor az elegy vizsgálata alapján a (II) képletű 7-ADCA hozama maximumot ér el. A találmány szerinti eljárásban felhasználható hor-65 dozóanyagot az (I) általános képletű vegyületeket dez-3
