163274. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 17alfa, 21-dihidroxi-pregna- 1,4-dién-3,20-dion- 17-acetát előállítására
3 163274 4 Megállapítottuk, hogy a Reichstein-S-17-acetát Al-dehidrogénezését a Corynebacterium equi és aNocardia blackwellii is elvégzik. Talajból izoláltunk egy Nocardia sp. 3/4 törzset (letétbe helyezve az Országos Közegészségügyi Intézetben a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében, MNG 67), mely Al-dehidrogénező képessége mellett jelentős A4-A5-izomeráz-, 3 ß-hidroxi-szteroid-oxidoreduktaz-, valamint észteráz-aktivitással is rendelkezik, ennek folytán képes a Al-Reichstein-S-17-acetátot egy fermentációs folyamatban 3ß, 17a, 21-trihidroxi-pregn-5-én-20--on-3,17,21-triacetátból, mely a 3ß-hidroxi-pregna-5,16--dién-20-on-3-acetátból kiinduló Reichstein-S-17-acetát szintézis intermedierje. Mivel a mikroorganizmus a 21-es és a 3-as acetát-csoportok hidrolízisét, a 3ß-hidroxilcsoport ketonná való oxidációját, a A5-ös kettős kötés A4-es helyzetűvé való izomerizálását és az 1,2-helyzetű dehidrogénezést egymást követően elvégzi, nagyon gazdaságos eljárást tesz lehetővé a Al-Reichstein-S-17-acetát előállítására. A 3ß, 17a, 21-trihidroxi-pregn-5-én-20-on-3,17,21-triacetátból kiinduló eljárás kivitelezésének körülményeit vizsgálva azt találtuk, hogy az átalakítás során a fermentlé pH-ját 5,5 körüli értéken, hőmérsékletét pedig 37 °C körüli értéken kell tartani, hogy a kívánt termék optimális keletkezését biztosíthassuk. A találmány tárgya eljárás 17a, 21-dihidroxi-pregna-l,4-dién-3,20-dion-17-acetát előállításáramikrobiológiai átalakítással, azzal jellemezve, hogy az átalakítást 17a, 21-dihidroxi-pregn-4-én-3,20-dion-17-acetátból Arthrobacter simplex (MNG 66), vagy 3ß, 17a, 21-trihidroxi-pregn-5-én-20-on-3,17,21-triacetátból Nocardia sp. 3/4 (MNG 67) alkalmazásával végezzük, és a terméket a férmentléből önmagában ismert módszerekkel különítjük el. A találmány lehetőséget teremt a gyulladásgátló hatású prednizolon egy intermedierjének gazdaságos előállítására fermentációs úton, hasadó gombák felhasználásával. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: /. példa Arthrobacter simplex (MNG 66) egyhetes, burgonyás ferde agáron nőtt tenyészetéből 8 ml steril vízzel szuszpenziót készítettünk és ebből 1 ml-rel oltottunk 100 ml 0,44% KH2P0 4 -ot, 0,88% Na 2 HP0 4 .7H 2 0-t és 2,0% élesztőkivonat szárazanyagot tartalmazó, 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett táptalajt. A beoltott lombikot 37 °C-os termosztát-szobában rázatva inkubáltuk 1 napig. Az egynapos tenyészet 5—5 ml-ével 5 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100—100 ml alábbi összetételű táptalajt oltottunk: 0,1 % aszparagin 0,1 % kukoricalekvár (szárazanyag) 0,4% élesztőkivonat (szárazanyag) 0,l%KH2 PO 4 0,5% glukóz 1,0% „nyomelem oldat" pH sterilezés előtt 6,5—7,0 értékek közé állítva. A táptalajhoz használt „nyomelem oldat" összetétele: 5 1 g CaCl2 10 mg Co(N03 ) 2 -6H 2 0 88 mg ZnS04 -7H 2 0 3,9 mg CuS04 -5H 2 0 1,0 mg NiS04 -7H 2 0 10 0,8 mg Na2B4 0 7 -10H 2 O 0,72 mg MnCl2 -4H 2 0 0,37 mg (NH4 ) 6 Mo 7 0 24 -4H 2 0 l,0mgFeSO4 -7H 2 O 1 literre desztillált vízzel feltöltve. 15 A beoltott táptalajt tartalmazó lombikokat 37 °C-os termosztát-szobában 24 órán át rázattuk. Ezután a tenyészethez lombikonként 10 mg hidrokortizont adtunk 20 és még 2 órán át rázattuk. Az így nyert, indukált tenyészetet desztillált vízzel 10-szeresére hígítottuk, majd 5 liter hígított tenyészethez fermentorban 2,5 g Reichstein-S-17-acetátot adtunk 20 ml 2g kalciumkloridot tartalmazó metanolban oldva. Az adagolás után a tenyészetet 25 37 °C-on inkubáltuk 300/perc fordulatszámmal kevertetve, percenként 5 liter levegő átáramoltatása mellett 48 órán át. Ezután a fermentlét 3 X1/4 térfogat etilacetáttal ext-30 raháltuk. Az egyesített extraktumokat szárazra pároltuk A bepárlási maradékot etilacetátból átkristályosítva 1,45 g Al-Reichstein-S-17-acetátot nyertünk. Az anyalúgot bepároltuk. A kapott maradékból etilacetátos kristályosítással további 0,42 g Al-Reichstein-S-17-ace-35 táthoz jutottunk; o. p. 187—190 °C, (a)D = -11 (c = 1, kloroform) Xraax 244m J uE!:t=425. 40 Elemi analízis: számított: C 71,48% H 7,82%; talált: C 71,45% H 7,79%. Infravörös színkép (KBr): vOH 3200—3600(max. 3420) 45 cm-1 , v c=o 1730 cm -1 (észterkarbonil és 20-as keton), vc=o 1660 cm -1 (3-as keton), v c=c 1615 és 1600 cm -1 (Al-es és A4-es kettős kötés). Mágneses rezonancia spektrum (CDC13 ): 18-as metil-csoport 8=0,71 ppm, 19-es metil-csoport 8 = 1,26 ppm, a 17-es acetát metil-50 csoportja 8 =2,08 ppm, 21-es metilén-csoport 8 =4,28 ppm. Az l-es, 2-es és 4-es protonek AMX spektrumot adnak. JAM = 10 Hz, J MX = 1,5 Hz, J AX =0. A spektrum adataiból számított 8X =6,1 ppm, 8 M =6,25 ppm, SA = 7,05 ppm. 2. példa A Nocardia sp. 3/4 (MNG 67) 5 db 1-hetes burgonyás 60 ferde agáron nőtt tenyészetéből 10—10 ml steril vízzel szuszpenziót készítettünk. 1—1 ml szuszpenzióval 50 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100—100 ml táptalajt oltottunk. A táptalaj 0,75% kukoricalekvárt, 0,6% élesztőkivonat szárazanyagot, 0,45% Na2 HP0 4 -65 -12 H2 0-t és 0,34% KH2 P0 4 -t tartalmazott. A beoltott, 2
