163157. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy polipeptid előállítására

163157 6 tó polipeptidhez hasonló tirokalcitonin előállítását. Ez utóbbi vegyülettől a találmány szerint előállítható polipeptid abban különbözik, hogy a 14-ihelyzetben arginilcsoport helyett lizilcsoportot és a 19-helyzetben fenilalanilcsoport helyett tirozilcsoportot tartalmaz. Az idézett közlemény ismerteti a találmány szerinti szintézis legtöbb kiindulási anyagának az előállítását is. A többi peptidfragmens előállítása vagy már ismeretes, vagy a peptidkémia hagyományos módszerei szerint történik. A következő példában ismertetjük a találmány szerinti eljárás gyakorlati végrehajtását korlátozás szándéka nélkül. A hőmérsékletet Celsius-fokban adjuk meg. Példa H-Cys-Ser-Asp(NH2

)-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu--Ser-Ala-Tyr-Try-Lys-Asp(NH2

)-Leu-Asp(NH2)-Asp(NH2

)-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2

. 6CH

:i

COOH . 10H

2

O 3,3 g ABCDEF peptidfragmenst nitrogénatmoszférában feloldunk 100 ml trifluorecetsavban, 15 percig 20°-on állni hagyjuk, majd bepároljuk. A száraz maradékot 300 ml 0,2 n ecetsavban oldjuk, 20 ml Amberlit-IRA-410 (acetát) ioncserélővel kezeljük, liofilizáljuk, dietiléterrel mossuk, és nagyvákuumban káliumhidroxidon megszárítjuk. A címben megnevezett vegyületet kapjuk. .20 Olvadáspontja 220° (bomlik); [a]D

=—42° (c = = 1, n ecetsavban). A kapott polipeptid aminosav-összetétele 6 n sósavval való 16 órai hidrolízis után: Alai,i, Argi,0

, Asp

3

,9, Cys/2i,

6

, Glu

1)2

, Gly

3

,o, Hisi,i, Lys1;

i, Leu

2

,

9

, Meti.o, Phe

2

,

0

, Pro

2

,i, Ser

3)8

, Thri,

9

, Tyr2

,o,

Valo,9, (Tryi,o spektrofotometriával). A példában használt kiindulási anyagok a következőképpen készülnek. A peptidfragmens: H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 134 g Z-Thr-NH-NH2

-t —5°-on feloldunk 2 liter n sósavban, és hozzáadunk 0,55 liter n nátriumnitrit-oldatot. öt perccel később káliumkarbonátot adunk hozzá 9 pH-ig, a keletkezett azidot etilacetáttal extraháljuk, és hozzáadjuk 80 g H-Pro-NH2

-HCl 100 ml vízzel készült oldatát, 500 ml dimetilformamidot és 77 ml trietilamint. Az etilacetátot 20°-on vákuumban eltávolítjuk, és a reakciókeveréket 25°-on éjjelen át állni hagyjuk. Az oldatot vákuumban bepároljuk, a maradékot etilacetátban oldjuk, az oldatot vízzel, híg sósavval és vizes káliumkarbonát-oldattal mossuk, és nátriumszulfáton szárítjuk. Ezután vákuumban bepároljuk, meleg etilacetátban feloldjuk, és az oldatot lehűtjük. Z-Thr-20 -Pro-NH2

-t kapunk. Olvadáspontja 148°; [a]

D = —72° (c=l, 95%-os ecetsavban). Ezután 90 g 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Z-Thr-Pro-NH2

-t 2 liter dioxánban és 260 ml n sósavban oldunk, és atmoszferikus nyomáson 20°-on palládiumkatalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakciókeveréket leszűrjük, az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, a maradékot etilaoetáttal mossuk, és így H-Thr-Pro-NH2

. HCl-t 20 kapunk. Olvadáspontja 216°; [a] D

— —64° (c=l, 95%-os ecetsavban). Ezt a vegyületet 500 ml dimetilformamid, 50 ml víz és 32 ml trietilamin elegyében oldjuk, és hozzáadunk 118 g Z-Glu(OTB)-OCP-t és 800 ml tetrahidrofuránt. Éjjelen át 20°-on állni hagyjuk, vákuumban bepároljuk, és a maradékot dietiléterből átkristályosítjuk. Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2

-t kapunk. Ol-20 vadáspontja 65° (bomlik); [«]D

=—18° (c=l, dimetilformamidban). 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2

-t 1,5 liter dioxánban és 200 ml vízben oldunk, és atmoszferikus nyomáson 20°-on palládiumkatalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Az oldatot leszűrjük, vákuumban bepároljuk, és a maradékhoz dietilétert adva H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2

-t kapunk. Olvadáspontja 65° (bomlik); 20 [a]D

=—28° (c=l, dimetilformamidban). Ezt a vegyületet 700 ml dimetilformamidban 0°-on oldjuk, hozzáadunk 200 ml acetonitrilt, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH-t, 18 g N^hidroxiszukcinimidet és 32 diciklohexilkarbodiimidet, éjjelen át 20°-on állni hagyjuk, leszűrjük, a szüredéket vákuumban bepároljuk, és etilacetátot adunk hozzá. Az oldatot vízzel, híg sósavval és vizes káliumkarbonát-oldattal mossuk, nátriumszulfáton szárítjuk, vákuumban bepároljuk, és a maradékot etilacetát és dietiléter elegyéből átkristályosítjuk. Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH

2-t 20 kapunk. Olvadáspontja 120° (bomlik); [a]j-j = = —66° (c=l, dimetilformamidban). Ezt 1500 ml dioxán és 300 ml víz elegyében oldjuk, hozzáadunk 30 g 10%-os palládiumszenet, és a hidrogénfelvétel megszűntéig hidrogénezzük. A reakciókeveréket leszűrjük, a szüredéket bepároljuk, és a maradékot dioxánból átkristályosítjuk. Így az A peptidfragmenst kapjuk. Olvadáspontja 20 153°; [a]D

-=—79° (e=l, dimetilformamidban). B peptidfragmens: BOC-Sér-Gly-Met-Gly-OH a) H-Met-Gly-OEt. HCl 65 g BOC-Met-OH-t feloldunk 900 ml kloroformban, az oldatot —10°-ra hűtjük, és hozzáadunk 30 ml N-metilmorfolint és 35,6 g klórhangyasav-izobutilésztert. 10 perccel később lassan hozzáadjuk 30 g glicin-etilészternek 200 ml kloroformmal készült oldatát, és 20°-on 1 óra hoszszat reagálni hagyjuk. Ezután 0,5 n ammóniaoldattal, majd 0,2 n kénsawal extraháljuk, vízzel semlegesre mossuk, nátriumszulfáton szárítjuk, és koncentráljuk. Petroléterből átkristályosítva BOC-Met-Gly-OEt-t kapunk. Olvadáspont-